בידוד של קטן noncoding RNAs מסרום האדם
Summary
פרוטוקול זה מתאר שיטה להפקת RNA קטן מסרום אדם. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי לבודד מיקרו RNA בסרום מהסרטן לשימוש במערכי ה-DNA וגם PCR כמו singleplex. הפרוטוקול מנצל ריאגנטים פנול וthiocyanate guanidinium עם שינויים להניב RNA באיכות גבוהה.
Abstract
הניתוח של RNA והביטוי שלה הוא תכונה נפוצה במעבדות רבות. משמעות היא הופעתה של RNA קטן כמו מיקרו RNA, אשר נמצאים בתאי יונקים. RNAs הקטן אלה הם רגולטורים גן עוצמה שליטה מסלולים חיוניים כגון צמיחה, פיתוח ומוות ועניין רב כבר מופנים כלפי הביטוי שלהם בנוזלי גוף. זאת בשל חוסר הוויסות שלהם במחלות בבני אדם כגון סרטן ויישום הפוטנציאל שלהם כסמנים ביולוגיים בסרום. עם זאת, הניתוח של ביטוי מירנה בסרום עשוי להיות בעייתי. ברוב המקרים הסכום של סרום הוא להגביל וסרום מכיל כמויות נמוכות של רנ"א הכל, מתוכם RNAs הקטן מהווים 0.4-0.5 1% בלבד. לכן הבידוד של כמויות מספיקות של RNA האיכותי מסרום הוא אתגר גדול לחוקרים כיום. במאמר זה טכני, אנחנו מדגימים שיטה שבה משתמשת רק 400 μl של סרום אנושי להשיג RNA מספיק לאף אחד ממערכי ה-DNA או ניתוח qPCR.dvantages של שיטה זו הוא הפשטות והיכולת להניב RNA באיכות הגבוהה שלה. זה לא דורש עמודות מיוחדות עבור טיהור של RNA הקטן ומנצל חומרים כימיים בכלל וחומרה שנמצאו במעבדות משותפות. השיטה שלנו מנצלת שלב נעילת ג'ל כדי למנוע זיהום פנול ואילו באותו הזמן מניב RNA באיכות גבוהה. גם אנחנו מציגים את צעד נוסף כדי להסיר את כל המזהמים נוספים במהלך שלב הבידוד. פרוטוקול זה הוא יעיל מאוד בבידוד תשואות של RNA הכולל של עד 100 ng / μl מסרום, אבל יכול גם להיות מותאם לרקמות ביולוגיות אחרות.
Introduction
בשנים האחרונות, חלה דחיפה גוברת לגלות סמנים ביולוגיים חדשניים לגילוי המוקדם של מחלות בבני אדם. תשומת לב רבה התמקדה באמצעות RNA קטן כגון מיקרו RNA 2 (miRNAs או מירס) כסמנים פוטנציאליים. RNAs הקטן אלה נמצאים בנוזלי גוף כגון סרום ומחקרים הראו שהם עמידים לפירוק ויציבים על פני טווח של תנאים סביבתיים משתנים 3. בהתחשב miRNAs תכונות, הסרום או במחזור אלה הם הסמן הביולוגי האידיאלי 4, 5. נכון לעכשיו יש שתי גישות עיקריות לבידוד של RNA הקטן מנוזלים ביולוגיים. הגישה הראשונה משתמשת בטכנולוגיה מבוססת עמודה להיקשר וelute RNA הקטן 6, ואילו הגישה השנייה משתמשת בפרוטוקול ארוכת השנים עם חומרים כימיים פנול וthiocyanate guanidinium 7. פיתחנו פרוטוקול פשוט, יעיל, ללא עמודה כדי לבודד RNAs הקטן מסרום אדם. RNA הבודד הוא היא מידately שמיש ביישומים במורד הזרם, כוללים מערכי oligonucleotide DNA ורצף RNA.
פרוטוקול זה פותח בגלל שאנחנו מתמודדים עם כמה בעיות בעת השימוש בשיטות המבוסס על פנול לבודד RNA מסרום. גישת Chomczynski המסורתית משמשת לעתים קרובות ברוב המעבדות עם מגוון של חומרים כימיים זמינים מרוב הספקים מסחריים. עם זאת שוקל השימוש הנרחב שלהם, הנחיות מחמירות שלא פותחו באופן עקבי לייצר RNA איכות גבוהה מנוזלי גוף, בדם או בסרום מסוים.
בעיות נפוצות הקשורות לבידוד RNA מן הסרום כוללות תשואות RNA נמוכות וזיהום עם חומרים כימיים המשמשים בבידוד, במיוחד פנול. הגישה שלנו מבטלת מזהמים פנול אלה כדי לספק RNA באיכות גבוהה לניתוח במורד כגון PCR כמוני (qPCR) ורצף RNA. בדקנו עוד RNA זה על מערכי מירנה.
Protocol
Representative Results
Discussion
האוכלוסייה של מיקרו RNA מהווה כ 0.4-0.5% מרנ"א הכל נמצא בסרום. בהמשך יש גם תכולת חלבון גבוהה שנמצאה בסרום אדם. כדי לשפר את RNA ולהפחית חלבון וגם פנול מזהם יש לנו שונה בגישה המסורתית Chomczynski 9 עם התוספת של כמה צעדים.
RNA סה"כ היה מבו?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
סמנתה חורי ופמלה Ajuyah נתמכים לאחר התואר הראשון בפרס האוסטרלי על ידי. אנחנו רוצים גם להכיר ברשת Translational חקר הסרטן, לואי מרכז לחקר הסרטן, אוניברסיטת ניו סאות' ויילס והצפון Translational היחידה לחקר הסרטן לקבלת תמיכה הנוספת של סמנתה חורי.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/ Description (optional) |
| Tri-Reagent RT LS | Molecular Research Centre, USA | TR 118 | – |
| RNase free H20 | GIBCO Invitrogen | 10977-023 | – |
| Proteinase K | Finnzymes, Finland | EO0491 | – |
| Heavy Phaselock Tube | 5PRIME | 2302830 | 2ml capacity |
| DNA Lobind tube | Eppendorf | 0030 108.078 | 1.5ml capacity |
| Glycogen | Invitrogen, USA | 10814-010 | 5mg/ml |
| RNA grade Isopropanol | Sigma Aldrich, USA | I9516 | 100% |
| Refrigerated Centrifuge | John Morris | – | – |
| Nanodrop UV-Vis spectrophotometer | Thermo Fisher Scientific, USA | – | – |
| RNA grade Ethanol | Sigma Aldrich, USA | E7023 | 70% |
| Agilent 2100 Bioanalyser | Agilent, USA | – | – |
References
- Babu, S. Monitoring extraction efficiency of small RNAs with the Agilent 2100 Bioanalyzer and the Small RNA Kit. Agilent Application Note. , (2010).
- Tran, N., Hutvagner, G. Biogenesis and the regulation of the maturation of miRNAs. Essays Biochem. 54, 17-28 (2013).
- Chim, S. S., et al. Detection and characterization of placental microRNAs in maternal plasma. Clin. Chem. 54, 482-490 (2008).
- Lodes, M. J., et al. Detection of cancer with serum miRNAs on an oligonucleotide microarray. PLoS One. 4, (2009).
- Chen, X., et al. Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases. Cell Res. 18, 997-1006 (2008).
- Burgos, K. L., et al. Identification of extracellular miRNA in human cerebrospinal fluid by next-generation sequencing. RNA. 19, 712-722 (2013).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, 156-159 (1987).
- Zhang, X., et al. Alterations in miRNA processing and expression in pleomorphic adenomas of the salivary gland. Int. J. Cancer. 124, 2855-2863 (2009).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. The single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction: twenty-something years on. Nat. Protoc. 1, 581-585 (2006).
- Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, (2011).
- Murphy, N. R., Hellwig, R. J. Improved nucleic acid organic extraction through use of a unique gel barrier material. Biotechniques. 21, 934-936 (1996).
- Taylor, C. J., Satoor, S. N., Ranjan, A. K., Pereira e Cotta, M. V., Joglekar, M. V. A protocol for measurement of noncoding RNA in human serum. Experimental Diabetes Research. 2012, (2012).
- Ichikawa, M., Akiyama, H. A Combination of Extraction Reagent and DNA Microarray That Allows for the Detection of Global MiRNA Profiles from Serum/Plasma. Methods Mol. Biol. 1024, 247-253 (2013).
- Fromm, B., Harris, P. D., Bachmann, L. MicroRNA preparations from individual monogenean Gyrodactylus salaris-a comparison of six commercially available totalRNA extraction kits. BMC Res. Notes. 4, 217 (2011).
- Li, Y., Kowdley, K. V. Method for microRNA isolation from clinical serum samples. Anal. Biochem. 431, 69-75 (2012).
- McAlexander, M. A., Phillips, M. J., Witwer, K. W. Comparison of Methods for miRNA Extraction from Plasma and Quantitative Recovery of RNA from Cerebrospinal Fluid. Frontiers in Genetics. 4, 83 (2013).
- Kim, Y. K., Yeo, J., Kim, B., Ha, M., Kim, V. N. Short structured RNAs with low GC content are selectively lost during extraction from a small number of cells. Mol. Cell. 46, 893-895 (2012).
