Summary
Graviditet fører til vesentlige endringer i fettsyresammensetning i mors vev. Lipidprofil kan fås via gasskromatografi å tillate identifisering og kvantifisering av fettsyrer i enkelt lipidklassene blant rotter fôret med ulike høyt og lavt fettinntak under svangerskapet.
Abstract
Gasskromatografi (GC) er en meget følsom fremgangsmåte for å identifisere og kvantifisere fettsyre-innhold av lipider fra vev, celler og plasma / serum, gir resultater med høy nøyaktighet og høy reproduserbarhet. I metabolske og ernæringsstudier GC tillater vurdering av endringer i fettsyrekonsentrasjonen følgende intervensjoner eller under endringer i fysiologisk tilstand som for eksempel graviditet. Fastfase-ekstraksjon (SPE) ved hjelp aminopropyl silika patroner tillater separering av de store lipidklasser inkludert triacylglyceroler, forskjellige fosfolipider, og kolesteryl estere (CE). GC kombinert med SPE ble brukt for å analysere endringer i fettsyresammensetningen av CE fraksjonen i leveren hos jomfruelig og drektige rotter som var blitt matet forskjellige høye og lave fettinntak. Det er betydelige diett / graviditet interaksjons effekter på omega-3 og omega-6 fettsyrer innhold av leveren CE, noe som indikerer at gravide kvinner har en annen reaksjon på kosten manipulation enn det som er sett blant jomfruelige kvinner.
Introduction
Gasskromatografi (GC) er en veletablert teknikk som brukes for å identifisere og kvantifisere inkorporering av fettsyrer til lipid bassenger og cellemembraner 1,2 under kosttilskudd eller fysiologiske tilstander som fedme (og beslektede sykdommer som for eksempel diabetes) eller graviditet 3 - 5. Det er også egnet til å analysere hvilke typer og mengder av fett i matvarer. Dette er nyttig når karakter eksperimentelle dietter, samt å sikre at næringsmiddelindustrien er i samsvar med regelverket. For eksempel kan GC bli brukt til å bekrefte identiteten og mengden av fettsyrer i løpet av et produkt, for eksempel som kosttilskudd for å sikre at merkingen er riktig, og bestemmelser følges 6,7. Analyse av fettsyrer kan gi verdifull innsikt i lipidmetabolismen i helse og sykdom, virkningen av kosttilskudd endring, og effekten av endringer i fysiologiske tilstand åtte. Bruk av GC for å studere prøvene under svangerskapet har gitt viktiginformasjon om endringer i fettsyre og komplekse lipid homeostase 3.
I forkant av den kromatografiske separasjon, blir lipider typisk ekstrahert fra prøven ved hjelp av løseligheten av lipider i oppløsningsmiddel-blandinger av kloroform og metanol. Natriumklorid ble tilsatt for å lette separasjonen av blandingen i vandige og organiske faser inneholdende lipid 9,10. Komplekse lipidklasser av interesse kan skilles fra det totale lipid-ekstrakt ved fastfase-ekstraksjon (SPE). Denne separasjonsteknikk elutes lipid klasser basert på deres polaritet eller bindende affinitet. Triacyglycerols (TAG) og kolesteryl estere (CE) elueres først som en kombinert fraksjon, ytterligere klasser, fosfatidylcholin (PC), er Fosfatidyletanolaminsyntese (PE), og ikke-forestrede fettsyrer (NEFA) ble eluert ved å øke polariteten av elueringsmiddel . Separeringen av TAG fra CE utnytter binding av TAG bare til en frisk patron SPEdge, slik CE for å bli eluert. TAG kan deretter elueres ved å øke polariteten av oppløsningsmidlet under eluering 9,10. Denne metoden gjør at flere prøver som skal separeres samtidig med et høyere utbytte enn det som oppnås med tynnsjiktskromatografi, hvilket betyr at forholdsvis små størrelser prøver (f.eks <100 pl plasma eller serum, <100 mg vev) kan analyseres 11,12.
GC er en veletablert teknikk som først ble beskrevet i 1950, ble det foreslått at den mobile fase i så væske-væske-systemer kunne erstattes med damp. Den ble opprinnelig brukt for petroleumsanalyse, men raskt utvidet til andre områder som aminosyreanalyse og lipid biokjemi, som fortsatt er av stor interesse. Fremskritt i GC utstyr og teknologi som for eksempel utvikling av kapillarkolonner fra de tidligere brukte pakkede kolonner har ført til våre nåværende teknikker der fettsyrer er i stand til å væresepareres mer effektivt ved lavere temperaturer resulterer i GC blir rutinemessig brukt for å identifisere og kvantifisere fettsyrer i en lang rekke undersøkelser 13.
GC krever Fettsyrer som kan derivatiseres slik at de kan bli tilstrekkelig flyktig til å bli eluert ved rimelige temperaturer uten termisk nedbrytning. Dette innebærer vanligvis at substitusjon av en funksjonell gruppe inneholdende hydrogen for å danne estere, tioestere eller amider for analyse. Metylestere er vanligvis studerte derivater, som er fremstilt ved metylering. I denne metoden esterbindingene i komplekse lipider er hydrolysert for å frigjøre frie fettsyrer, som er transmetylert å danne fettsyre metylestere (FAME). Den resulterende profil av FAME, bestemt ved GC, som refereres til som fettsyresammensetningen og kan lett sammenlignes mellom ulike forsøksgrupper 9,10. Teknikken gjør at både proporsjonene av individual fettsyrer og deres konsentrasjoner som skal måles.
I tillegg til bruk av GC for analyse av fettsyrer i ernæring studier og innenfor næringsmiddelindustrien, kan teknikken benyttes over et bredt utvalg av analytiske felt. For eksempel miljøanalyser ved hjelp av GC inkluderer måling av vannforurensning av insektmidler og jord analyser måle chlorobenzene innhold. I toksikologi, har GC også blitt brukt til å identifisere ulovlige stoffer i urin og prøver av individer blod; en slik sport ytelse enhancers 12 og evnen til å skille komplekse blandinger av hydrokarboner gjør denne teknikken populær i petroleumsindustrien for petrokjemisk analyse 12.
Svangerskapet er forbundet med betydelige endringer i fettsyresammensetning i mors vev, spesielt i innholdet av omega-3 (n-3) og omega-6 (n-6) flerumettet fettsyre acids (PUFA) tre. I denne studien, vi eksempler på bruk av GC i måling av fettsyrer ved å beskrive dens anvendelse ved analyse av fettsyresammensetningen av levervev tatt fra jomfruelig og drektige rotter matet lavt og høyt fettinntak med forskjellige oljekilder. De eksperimentelle dietter som tilbys her var en fettfattig soyaolje basert diett, en fettrik soyaolje-basert diett (130.9 g fett / kg total fett) eller en fettrik linolje-basert diett (130.9 g fett / kg diett), forutsatt i 20 dager. Den fulle næringsstoffer og fettsyresammensetning i disse diettene er blitt beskrevet tidligere 14. De soyaolje dietter er rike på linolsyre (18:02 n-6) og inneholder en α-linolensyre (18:03 n-3), mens linolje dietten er rik på α-linolensyre. Disse høy-fett dietter representerer ulike rasjoner av linoleic til α-linolenic syrer (rasjoner av 08:01 og 01:01, henholdsvis). Fremgangsmåten for isolering av de enkelte lipidklasser og analyse ved GC er vill etablert og validert, og har vært publisert tidligere 10, men uten detaljert teknisk beskrivelse funnet her.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
En. Animal Prosedyrer
- Alle dyr arbeid skal utføres i samsvar med hjemmekontor Dyr (vitenskapelige prosedyrer) Act (1986).
- Mate Wistar rotter i alderen 10 uker gamle ved monogame avl, og bekrefte graviditeten av utseendet til en vaginal plugg. Spill dette som dag 1 av svangerskapet, og starte eksperimentell diett. For jomfruelige kvinner, huse hver rotte individuelt, og starte eksperimentell diett.
- Etter fôring de eksperimentelle dietter for 20 dager avlive rotter av CO 2 kvelning fulgt ved halshugging.
- Bruk disseksjon pinsett og saks for å eksponere bukhulen og avgiftsdirektoratet leveren ved å kutte leddbånd, som forbinder leveren til membranen, fremre vegg av magen, mage og tolvfingertarm. Vask leveren i PBS og fryses i flytende nitrogen før lagring ved -80 ° C.
2. Utarbeidelse av en Total lipidekstraktet 9
- Legg molecular sikter (for å fylle 1/10 av løsningsmiddelbeholder) til alle løsningsmidler for å skape "tørre" løsningsmidler. Gjennomfør alt oppløsningsmiddel arbeider innenfor en avtrekkshette.
- Skjær ca 100 mg frosset leveren og veie. Plasser vevet inn i et rør i en isbøtten og tilsett 0,8 ml iskald 0,9% NaCl. Homogen vevet.
- Legg interne standarder oppløst i 1 ml / mg tørr kloroform: metanol (2:1, v / v) inneholdende butylert hydroksytoluen (BHT, 50 mg / l) som anti-oksydant. For 100 mg av rottelever legge 100 mikrogram av CE-standarden (Cholesteryl heptadecanoate 17:00). Forsiktig: Kloroform og BHT er farlig.
- Til 5,0 ml tørr kloroform: metanol (2:1, v / v) inneholdende BHT (50 mg / L).
- Tilsett 1,0 ml 1 M NaCl, blandes grundig ved virvling til blandingen ser uniform. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
- Sentrifuger ved 1000 xg i 10 min, lavt bremse ved romtemperatur.
- Samle laverefase ved hjelp av glass Pasteur pipette, overføring til ny skrukork glassrør og tørr under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
Tre. Separasjon av lipidklasser ved fastfase-ekstraksjon (SPE) 10
- Koble SPE tank til en vakuumpumpe og plassere aminopropyl silika SPE-patronen i tanken.
- Plasser ny skrue-cap glassrør merket TAG og CE i tanken stativ under kolonnen for å samle første brøk.
- Oppløse den totale lipid ekstrakt i 1,0 dl tørr kloroform og vortex.
- Påfør prøven til kolonnen ved hjelp av en glass Pasteur-pipette og la det dryppe gjennom i rør med skrukork følge av tyngdekraften. Når ingen ytterligere drypper falle, fjerne gjenværende væske ved hjelp av vakuum.
- Eluer TAG og CE-fraksjon under vakuum, vaskes kolonnen med 2 x 1,0 ml-vaskinger med tørr kloroform.
- Når all væske er fjernet, tørk TAG og CE fraction under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
- Plasser ny skrulokk glassrør merket PC inn i tanken skuffen under kolonnen.
- Eluer PC fraksjonen under vakuum ved tilsetning av 2 x 1,0 ml tørr kloroform: metanol (60:40, v / v) inntil all væske er fjernet fra kolonnen.
- Ta ut og tørr PC brøkdel under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
- Plasser en ny skrue-hetten glassrør merket PE inn i tanken skuffen og eluere PE fraksjon med tilsetning av 1,0 ml tørr metanol under vakuum.
- Ta ut og tørr PE brøkdel under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
- Plasser ny skrulokk glassrør merket NEFA inn i tanken skuffen og eluere NEFA fraksjon under vakuum ved tilsetning av 2 x 1,0 ml vaskinger med tørr kloroform: metanol: iseddik. (100:2:2, v / v / v) Forsiktig: Iseddiksyre er farlig.
- Fjern oppsamlet NEFA fraksjon og tørr under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
- Plasser en ny aminopropyl silika SPE patronen på SPE tanken og plassere en skrulokk glassrør i tanken skuffen under kassetten for å samle inn avfall.
- Vask kolonnen med 3 vaskinger med tørr heksan under vakuum, og deretter en endelig 1,0 ml vaske følge av tyngdekraften. Ikke la kassetten til å bli tørr (Snu kassetten kolonne kanaler til en lukket posisjon når heksan nivået er nær kassetten matrise). Forsiktig: Heksan er farlig.
- Bytt oppsamlings tube med ny skrue-cap glassrør merket CE.
- Løs opp det tørkede TAG og CE fraksjon (fremstilt i trinn 3.6) i 1,0 ml tørr heksan og virvle. Påfør denne til kolonnen ved hjelp av en glass Pasteur-pipette og la det dryppe gjennom henhold gravity.
- Når ingen ytterligere drypper falle, fjerne gjenværende væske under vakuum.
- Under vakuum, vaskes kolonnen med 2 x 1,0 ml vaskinger med tørr heksan for å eluere CE og tørr oppsamlet fraksjon under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
- Plasser ny skrulokk glassrør merket TAG i tanken skuffen og eluere TAG med tillegg av 2 x 1,0 ml vaskinger med tørr heksan: metanol: etylacetat (100:5:5) under vakuum.
- Tørr samlet fraksjon under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke. Forsiktig: Etylacetat er farlig.
4. Utarbeidelse av FAME fra CE 10
- Tilsett 0,5 ml tørr toluen til den separerte CE fraksjon (samlet i trinn 3.19) og vortex. Forsiktig: Toluen er farlig.
- Forbered metylering reagens (tørr metanol med 2% (v/ V) H 2 SO 4), hvorav 1,0 ml er nødvendig per prøve. Tilsett volum med tørr metanol i glass eller egnet plastbeholder med lokk og legg den nødvendige mengden av H 2 SO 4 dråpevis og bland med inversjon. Forsiktig: Svovelsyre er farlig.
- Tilsett 1,0 ml av metylerings-reagens til prøvene oppløst i tørr toluen, cap rørene på en sikker måte, og bland forsiktig.
- Varm prøvene i 2 timer ved 50 ° C.
- Etter to timers fjerne rørene fra varmen. Når kule legger 1,0 ml nøytral løsning (0,25 M KHCO 3 0.5MK 2 CO 3). Forsiktig: Kalium bikarbonat og kaliumkarbonat er farlig.
- Legg 1,0 ml tørr heksan og vortex.
- Sentrifuger ved 250 x g i 2 min, lavt bremse ved romtemperatur.
- Samle øvre fase, som inneholder FAME og overfør til en ny ikke skrulokk disponibel glassrør.
- Tørk samlet FAME i henholdnitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke.
5. Fjerning av fritt kolesterol Forurensning fra CE FAME 14
(Gratis Kolesterol kan forurense prøven, se Figur 1 for eksempel kromatograf spor med og uten fri kolesterol fjerning).
- Plasser en avfallsrøret inn SPE tank og plassere en silikagel SPE-patron inn i tanken.
- Vask kolonne med 3 x 1 ml vasker med tørr heksan under vakuum, og 1 x 1 ml mindre enn tyngdekraften.
- Fjern avfalls vasker og legge nye avfallsrøret inn tank.
- Oppløse CE FAME i en ml tørr heksan, Vortex.
- Påfør til kolonnen ved hjelp av en glass Pasteur-pipette og la det dryppe gjennom under gravitasjon.
- Vask kolonne med 3 x 1 ml vaskinger med heksan under vakuum.
- Fjern avfalls vasker og plassere nye ikke skrukork i tank merket CE FAME.
- EluerCE-FAME med 2 x 1 ml tørr heksan: dietyleter (95:5 v / v) vasker.
- Tørk under nitrogen ved 40 ° C. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opp til en uke. Forsiktig: Dietyleter er farlig.
6. Overføring av FAME i GC Auto Sampler Vial
- Legg 75 mL tørr heksan å smake, vortex, og overføre til en GC auto sample hetteglass.
- Legg til en ytterligere 75 mL tørr heksan å smake, Vortex og overføre til den samme GC auto sample hetteglass. Prøver kan bli lukket og lagret ved -20 ° C på dette stadium i opptil en måned.
7. Analyse Bruke Gasskromatografsystemet 14
- Analyser FAME på en gasskromatograf. Eksempel satt opp: 30 mx 0,25 mikrometer x 0,25 mm BPX-70 smeltet silisiumdioksid kapillær kolonne med temperatur-protokollen:
Initial temperatur 115 ° C, hold 2 min, rampen 10 ° C / min til 200 ° C, holder 18.5 min, rampen 60 ° C / min til 245 ° C, hgamle 4 min.
Kolonne: Helium gass, strømningshastighet 1,0, press 14,6 og hastighet 29.
Injector: Temperatur = 300 ° C.
Detector: Hydrogen flyt 40,0, luft strømme 184,0, utgjør gass Helium, flyte 45,0, temperatur = 300 ° C. - Sett split ratio som hensiktsmessig (f.eks 25:1 for CE FAME analyse).
- Bestem arealet under hver topp ved hjelp av egnet programvare og identifisere FAME ved sammenligning med standarder. Se figur 2 for eksempel kromatogrammene.
- Bruke området under peak data til å beregne bidraget fra enkelte fettsyrer i prosent av totale fettsyrer.
- Beregn absolutte konsentrasjoner av fettsyrer ved å dele arealet av intern standard ved mengden tilsatt. Del-området av hver fettsyre ved dette produktet for å oppnå absolutte konsentrasjoner av hver fettsyre i mengden av vev som brukes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Suksessen med denne fremgangsmåten er avhengig av å følge protokollen presist og ved hjelp av rene løsningsmidler og reagenser for å redusere "støy", og forurensning som kan vises på et kromatogram. Forurensede prøver er mer utfordrende å analysere, senking nøyaktigheten av arealet under kurven beregninger. Dersom protokoll ble fulgt med hell et kromatogram med klare symmetrisk, godt definerte topper og med minimal bakgrunnsstøy skal opp-nås, som vist i figur 3.. Dersom forurensning har oppstått kromatogrammet viser flere topper, og oppviser ikke-symmetrisk (skjevt) topper som illustrert i figur 4.. Forurensning av fri kolesterol vil oppstå ved kjøring FAME avledet fra CE (se figur 1, med mindre cholesterol er fjernet (som beskrevet i protokoll 5).
Bruken av en preparert kalibrerings blanding gjør det mulig å identifisere den FAME in the prøven. Kalibrerings blandingen drives ved hjelp av de samme instrumentinnstillinger som prøvene, slik at kromatogrammet kan bli sammenlignet med prøven og topper identifiseres på riktig måte basert på deres retensjonstider, som illustrert i figur 2.
Peak område blir brukt til å beregne prosentandelen av spesifikke fettsyrer innen det totale. Når data er blitt samlet inn, er det nyttig å undersøke dem på utliggere, som vist i figur 5.. Avvikende prøver kan deretter bli videre undersøkt, og utvinning og / eller analyse gjentatt etter behov.
Å legge til en intern standard for å samples (som beskrevet i protokoll trinn 2.3) tillater kvantifisering av fettsyrer i prøven ved beregning ved hjelp av arealet av kjent mengde intern standard topp i forhold til området for toppen av interesse, og korrigert for opprinnelige prøven volum eller vekt. I tabell 1 er FAME i rottelever CE beskrevet som enprosent av totale fettsyrer (g/100 g total fatty acid) innenfor lever CE. Disse data beskriver CE fettsyrer i leveren av jomfru eller gravide rotter fôret i 20 dager på ett av tre forskjellige dietter. Statistisk analyse ved hjelp av to-faktor ANOVA (faktorer: kosthold, gravid vs virgin) avslører signifikante effekter av kosthold og graviditet ved andelen av flere fettsyrer, samt betydelige diett x graviditet interaksjoner (Tabell 1). Som en illustrasjon, Fig. 6 viser at arakidonsyre (AA, 20:04 n-6) Innholdet av lever CE hos drektige rotter blir mer påvirket av dietten enn jomfrue hunner.
Figur 1. Sammen gasskromatogram av identiske prøver som illustrerer betydningen av fri kolesterol fjernes i rottelevervevet. Klikk her for å se større bilde.
Figur 2. Eksempel på metoden som brukes til å identifisere prøven CE FAME fra rottelever vev ved hjelp av en forberedt kalibrering mix. En PRepared kalibrerings blandingen drives ved hjelp av de samme instrumentinnstillinger som prøvene, slik at kromatogrammene kan sammenlignes for å identifisere fettsyrer i prøven. Den medfølgende kromatogram for kalibrering blanding lar FAME i blandingen som skal merkes. Dette merkede spor kan deretter bli sammenlignet med kromatogram fra prøven hvor lett identifiserbare store topper kan sammenlignes med deres oppholdstider med de på kalibrerings blandingen deretter merket på hensiktsmessig måte. For eksempel fremhevet på sporet. er 16:00 for å illustrere sammenligning av retensjonstidene fra kalibrerings blanding ifølge til fettsyrene i prøven spor under tillate korrekt merking av fettsyrer. for å vise større bilde.
Figur 4. Eksempel på en forurenset NEFA gasskromatografi, erholdt fra humant plasma. For mange uventede tinder, som sirklet ved begynnelsen av prøven, som kan påvirke integrering av ekte topper. Toppene blir avbrutt og udefinert sett towar ds slutten av prøven, og har blitt skrå som sirklet. Dette vil påvirke nøyaktigheten av området under kurven beregninger og kvantifisering av disse fettsyrene. Klikk her for å se større bilde.
Figur 5. Identifisering av avvikende data blant fettsyresammensetning i leveren CE i jomfruelige rotter foret med en fettrik diett soyaolje (n = 6). Dette illustrerer hvor prosentdata analyseres av fettsyrer kan anvendes for å bestemme tvetydige resultater. Disse dataene indikerer at utvalgs 125 kan være en avvikende, og krever videre undersøkelser. De fem store fettsyrer innenfor CE (16:00, 18:00, 18:01 n-9, 18:02 n-6, 20:04 n-6) er ikke vist.. Jpg "target =" _blank "> Klikk her for å se større bilde.
Figur 6. Arakidonsyre innholdet i leveren CE blant jomfruelige og gravide rotter fôret med eksperimentelle dietter. Verdier er midler ± SD, n = 6. Midler uten et felles brev forskjellig, P <0,05. * Forskjellig fra jomfruelige kvinner innenfor matchet kosttilskudd gruppe, P <0,05. Dette er en visuell representasjon av resultatene fra Tabell 1 viser forskjellene i leveren CE innhold av jomfruelige rotter matet ulike dietter i forhold til gravide rotter fôret med de samme dietter. Forskjellene kan sees i hver diettgruppen mellom de jomfruelige og gravide rotter. Klikk her for å se større bilde.
Tabell 1. Fettsyresammensetning av rottelever kolesteryl estere av jomfruelige og gravide rotter fôret med eksperimentelle dietter. Verdier er midler (SD), n = 6. ND angir ikke påvist (gjennomsnittlig <0,1%). Midler uten et felles brev innen jomfru eller gravide kvinner er forskjellige, P <0,05. * Forskjellig fra jomfruelige kvinner innenfor matchet kosttilskudd gruppe, P <0,05. Denne tabell viser de gjennomsnittlige verdier av n-3-og n-6-fettsyrer som er tilstede i levervevet i jomfruelig og drektige rotter matet med lav og varierende høyt fettinntak. Resultatene ble statistisk analysert ved hjelp av variansanalyse (ANOVA) med et signifikansnivå på p <0,05 for forskjeller mellom jomfrue og drektige rotter, type kosthold og diett x graviditet interaksjon. ANOVA Resultatene tyder det er betydelige forskjeller i nivåene av arakidonsyre (20:04 n-6) mellom jomfru og drektige rotter innenfor mmatchet med kosttilskudd grupper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Gass-kromatografi er en nøyaktig teknikk til bruk for fettsyre-analyse, og dens høy reproduserbarhet anser denne teknikken er egnet for kliniske analyser. Egnede GC-kolonner må brukes for å muliggjøre identifisering av fettsyrene av interesse, som har tilgjengelige kolonner som har variasjoner i polariteten av den stasjonære fase, kolonne lengde og innvendig diameter. Bruken av en kapillarkolonne av smeltet silisiumdioksyd i denne analysemetoden gir en god termisk stabilitet og høy reproduserbarhet av retensjonstider på grunn av sin høye overflate inerthet og god oppløsning 8..
Kritiske trinnene i denne protokollen omfatter nedre og øvre fase samling trinn (protokoll trinn 2,7 og 4,8). Det er viktig at mest mulig av den riktige fase oppsamles som mulig uten forurensning med hvilken som helst av den uønskede fase. Tilstedeværelsen av forurensninger i en prøve, vil resultere i en uønsket kromatografisk utgangs, Som illustrert i figur 2. Ved innsamling av CE under SPE er det viktig at patron kolonner holdes mettet med løsemiddel (trinn 3.15) følge vasker med heksan for å sikre prøven penetrerer kolonne for å tillate vellykket separasjon av CE fra TAG. Den videre separasjon av CE for å fjerne fritt kolesterol er viktig for å unngå forurensning som vises på kromatograf spor som vist i figur 1. Det er også viktig for å sikre at fremgangsmåten som krever fjernelse av væske under vakuum blir fulgt nøyaktig slik at all væske er fullstendig fjernet fra kolonnen for å sikre et godt utbytte.
Den viktigste begrensning av GC er det komplekse lipider som fosfolipider og triacyglycerols trenger å bli forsåpet før Derivatiseringen, for å danne FAME før analyse, slik at informasjon om de spesifikke strukturene av disse lipider og typiske kombinasjoner av fettsyrer er tapt 10.. Alle trinnene iDenne protokollen må utføres i en avtrekkshette på grunn av bruk av løsningsmidler, som begrenser egnetheten av omgivelsene denne metoden kan utføres i. Denne metoden kan også være tidkrevende for å analysere et lite antall prøver, typisk kjørt to arbeidsdager for å komme fra prøven av interesse for data-utgang, med mindre helautomatisk prosedyrer benyttes. Imidlertid, ved behandling av store antall prøver, hvert trinn kan utføres i grupper for å øke tidseffektiviteten til denne teknikk og tilgjengelighet av utstyr for andre brukere. Visse teknikker innenfor protokollen krever praksis og fingerferdighet som øvre og nedre fase ekstraksjoner (trinn 2,7 og 4,8), noe som kan være et problem for folk med problematiske ledd eller som er utsatt for negative effekter av repeterende bevegelser.
Trinn i denne fremgangsmåte kan lett legges til eller fjernes for å lette samling av forskjellige fraksjoner for et bredt spekter av prøvens, for eksempel PE samling kan ikke være nødvendig når analysere plasma, men er av interesse i celle-og vevsprøver 10. Denne metoden kan også bli modifisert for analyse av celler av total lipid ekstrakter, hvor SPE-trinn kan utelates hvis det er ønskelig. En slik variant er den som er beskrevet for røde blodlegemer, som utelater total lipid ekstraksjon, samt SPE trinn 15. I motsetning til den aktuelle protokoll, hvilken metode som brukes i denne undersøkelsen benytter 250 pl av et metylerings-reagens (14% bortrifluorid), som er lagt direkte til røde celler sammen med 250 pl av heksan og oppvarmet i 10 minutter ved 100 C. ˚ Denne nøytralisering trinnet er utelatt og i stedet vann og heksan tilsatt, prøven blir deretter sentrifugert og heksan øvre fase samles og overføres direkte til et GC-auto-sampler ampulle uten tørking under nitrogen og re-oppløsning i heksan.
GC er en allsidig metode og gir reliable resultater med et utvalg av tilgjengelige modifikasjoner 15 og kan brukes til å analysere en rekke prøver. Det har fordeler i forhold til masse-spektrometri (MS) ved analyse av n-6 og n-3 fettsyremetabolisme som den er i stand til å skille mellom strukturelt lignende fettsyrer som den bruker retensjonstid for merking i motsetning til atommasse. MS er i stand til å identifisere fettsyrer i en prøve, men ute av stand til å skille dobbeltbinding-stillinger i stereoisomerer, og derfor ute av stand til å fortelle visse fettsyrer fra hverandre. Om nødvendig, kan begge metodene brukes i tandem med GC-MS 16. Denne teknikken blir anvendt under undersøkelse av lipid metabolisme og-funksjon innen lipidomics. Bruken av GC i tandem med MS har ført til store fremskritt som det tillater manipulering av fettsyre identifikasjon ved bruk av ulike stasjonære faser i GC til å diskriminere mellom fettsyrer som MS alene ikke kan. GC kan også brukes i kombinasjon med elektron innvirkning massespektrometri(EI-MS), som gir mulighet for identifisering av fettsyrer når de kombineres med alternative kjemiske derivater som pikolinylester estere. Dette utvider bruken av teknikken, og fortsetter å forbedre lipid profilering som forsknings fremgangsmåte i en rekke områder, som for eksempel fysiologi, klinisk biomarkør deteksjon, og patologi, så vel som lipid biokjemi 17..
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å takke bidraget fra Meritxell Romeu-Nadal til en studie på rotter.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Methanol | Fisher Scientific | M/4056/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Chloroform | Fisher Scientific | C/4966/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| BHT | Sigma- Aldrich | W218405 | 'CAUTION' Dust fumes - Anhydrous |
| NaCl | Sigma- Aldrich | S9888 | Anhydrous |
| Hexane | Fisher Scientific | H/0406/17 | 'CAUTION' Fumes - HPLC Grade |
| Glacial acetic acid | Sigma- Aldrich | 695084 | 'CAUTION' Burns - 99.85% |
| Sulfuric acid | Sigma- Aldrich | 339741 | 'CAUTION' Burns - 99.999% |
| Potassium carbonate | Sigma- Aldrich | 209619 | 99% ACS Reagent grade |
| Potassium bicarbonate | Sigma- Aldrich | 237205 | 99.7% ACS Reasgent grade |
| Ethyl acetate | Fisher Scientific | 10204340 | 'CAUTION' Fumes - 99+% GLC SpeciFied |
| Toluene | Fisher Scientific | T/2300/15 | 'CAUTION' Fumes |
| Diethyl ether | Sigma- Aldrich | 309966 | 'CAUTION' Fumes |
| Nitrogen (oxygen free) cylinder | BOC | 44-w | 'CAUTION' Compressed gas - explosion risk |
| Aminopropyl silica SPE cartridges | Agilent | 12102014 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Silica gel SPE cartidges | Agilent | 14102010 | Cartridge - Bead mass 100 mg |
| Molecular seives | Sigma- Aldrich | 334324 | Pellets, AW-300, 1.6 mm |
| Glass Pasteur pipettes | Fisher Scientific | FB50251 |
References
- Browning, L. M., et al. Incorporation of eicosapentaenoic and docosahexaenoic acids into lipid pools when given as supplements providing doses equivalent to typical intakes of oily fish. Am. J. Clin. Nutr. 96 (4), 748-758 (2012).
- Cao, J., Schwichtenberg, K. A., Hanson, N. Q., Tsai, M. Y. Incorporation and clearance of omega-3 fattyacids in erythrocyte membranes and plasma phospholipids. Clin. Chem. 52 (12), 2265-2272 (2006).
- Lauritzen, L., Carlson, S. E. Maternal fatty acid status during pregnancy andlactation and relation to newborn and infant status. Matern. Child Health. 7 (2), 41-58 (2011).
- Kelsall, C. J., et al. Vascular dysfunction induced in offspring by maternal dietary fat involves altered arterial polyunsaturated fatty acid biosynthesis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Karpe, F., Dickmann, J. R., Frayn, K. N. Fatty acids, obesity, and insulin resistance: time for a re-evaluation. Diabetes. 60 (10), 2441-2449 (2011).
- Mossoba, M. M., Moss, J., Kramer, J. K. Trans fat labelling and levels in U.S. foods: assessment of gas chromatographic and infrared spectroscopic techniques for regulatory compliance. J. AOAC Int. 92 (5), 1284-1300 (2009).
- Chee, K. M., et al. Fatty acid content of marine oil capsules. Lipids. 25 (9), 523-528 (1990).
- American oil chemists society. Gas chromatographic analysis of molecular species of lipids. , The Oily Press, Inc. Available from: http://lipidlibrary.aocs.org (2013).
- Folch, J., Lees, M., Sloane-Stanley, G. H. A simple method for the isolation and purification of total lipids from animal tissues. J. Biol. Chem. 226 (1), 497-509 (1957).
- Burdge, G. C., Wright, P., Jones, E. A., Wootton, S. A. A method for separation of phosphatidylcholine, triacylglycerol, non-esterified fatty acids and cholesterol esters from plasma by solid-phase extraction. Br. J. Nutr. 84 (5), 781-787 (2000).
- Seppänen-Laakso, T., Laakso, I., Hiltunen, R. Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition. Anal. Chim. Acta. 465 (1), 39-62 (2002).
- Beesley, T. E., Buglio, B., Scott, R. P. W. Quantitative chromatographic analysis. , Marcel Dekker. New York, NY. Part. (2000).
- Bartle, K. D., Myers, P.
- Childs, C. E. The effect of gender, pregnancy and diet upon rat tissue fatty acid composition and immune function. , University of Southampton, School of Medicine. Available from eprints.soton.ac.uk 378 (2008).
- Harris, S. W., Pottala, J. V., Ramachandran, S. V., Larson, M. G., Robins, S. J. Changes in erythrocyte membrane Trans and marine fatty acids between 1999 and 2006 in older Americans. J. Nutr. 142 (7), 1297-1303 (2012).
- Rohwedder, W. K. Mass spectrometry of lipids (USDA). Northern Regional Research Laboratory ARS. , Available from: ddr.nal.usda.gov/bitstream/10113/29457/1/CAIN769045540.pdf (2013).
- Roberts, L. D., McCombie, G., Titman, C. M., Griffin, J. L. A matter of fat: An introduction to lipidomic profiling method. J. Chromatogr. B. 871 (2), 174-181 (2008).
