الجمع بين التلاعب جزيء واحدة والتصوير لدراسة التفاعلات-DNA البروتين
Summary
نحن هنا وصف الأدوات والأساليب للكشف عن جزيئات البروتين وحيد fluorescently المسمى-التفاعل مع جزيء DNA واحدة معلقة بين اثنين المجهرية المحاصرين بصريا.
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
جزيء واحد (SM) التقنيات تطورت بشكل كبير خلال السنوات الثلاثين الماضية للرد على الحاجة إلى التغلب على بعض قيود التقليدية، والقياسات حل السائبة 1-3. وقد خلق التلاعب جزيئات بيولوجية واحدة فرصة لقياس الخواص الميكانيكية لل4 البوليمرات الحيوية والتحكم في عوامل الميكانيكية من البروتين البروتين 5 والتفاعلات DNA البروتين 6،7. SM كشف مضان، من ناحية أخرى، يمثل أداة مرنة بشكل لا يصدق لدراسة نشاط البروتين في المختبر وفي الجسم الحي، مما يؤدي إلى إمكانية توطين وتتبع الجزيئات واحدة مع الدقة نانومتر. من خلال تركيب الصك نقطة الانتشار وظيفة للصورة SM، في الواقع، يمكن للمرء تحقيق توطين بدقة اعتمادا أساسا على نسبة الإشارة إلى الضوضاء (SNR) وصلت إلى حد من حوالي 8،9 نانومتر. هذه المنهجيات تجد قويةتطبيقات في دراسة ديناميات بروتينات المحركات، وكذلك من عمليات الانتشار الكامنة وراء الهدف البحث في البروتينات الحمض النووي ملزم. القدرة على تحديد الثوابت نشرها بوصفها وظيفة من تسلسل الحمض النووي، وزمن البقاء على الهدف وبدقة قياس طول الحمض النووي استكشافها خلال نشر الأحداث ذات البعد الواحد، تمثل أداة قوية لدراسة ديناميكيات التفاعل بين البروتين والحمض النووي للتحقيق آليات البحث هدف محدد.
في الآونة الأخيرة، أنتجت مجموعة من هذه التقنيات اثنين جيل جديد من الاجهزة التجريبية 10-14 تمكين التلاعب المتزامن لالركيزة البيولوجية (على سبيل المثال على خيوط الأكتين أو جزيء DNA) والكشف / توطين انزيم شريك التفاعل (على سبيل المثال أو الميوسين بروتين ملزمة DNA). مزايا هذه التقنيات الراحة بشكل رئيسي على إمكانية ممارسة السيطرة الميكانيكية على البوليمر المحاصرين، وبالتالي ENAبلينغ دراسة ديناميات التفاعل مقابل القوات أو عزم الدوران. أيضا، منهجية تتيح قياس التفاعلات الكيميائية الحيوية بعيدا عن السطح، وتجنب واحدة من القيود الرئيسية للطرق SM الكلاسيكية، أي الحاجة إلى الشلل في الجزيئات قيد الدراسة على سطح (شريحة زجاجية أو المجهرية).
الجمع بين اثنين من التقنيات الجزيئات واحدة يتطلب التغلب على العديد من الصعوبات التقنية، والتي تنشأ أساسا من متطلبات الاستقرار الميكانيكية وSNR الكافي (وخصوصا عندما تتطلب توطين بدقة نانومتر) 15. خصوصا، عندما اقتران SM كشف مضان مع ملاقط بصرية، والحد من الضوضاء وphotobleaching من أشعة الليزر تحت الحمراء من 16 محاصرة والسيطرة على مخازن البيوكيميائية لتجميع المجمعات البيولوجية وأداء القياسات التجريبية 11 ذات أهمية قصوى. هنا، نحن تصف الأساليب لأداء ناجحةالقياسات في محاصرة المزدوج / SM الإسفار الإعداد الترجمة. ويتضح منهجية مع المثال من البروتين قامع اللاكتوز (اسي) fluorescently المسمى (مع Atto532) والكشف عن أنها تربط لجزيء الحمض النووي (محاصرين بين اثنين من ملاقط بصرية) التي تحتوي على متواليات محددة ملزمة اسي (أي المشغلين). نحن إثبات فعالية هذه الطريقة في الكشف عن ملزم من الحمض النووي لاسي ونشرها على طول كفاف في عملية البحث المستهدفة. هذه الطريقة تنطبق على أي مزيج من تسلسل الحمض النووي والبروتينات الحمض النووي ملزم، فضلا عن النظم الأخرى (الأنابيب الدقيقة أو خيوط الأكتين والبروتينات محرك التفاعل معهم).
Protocol
Representative Results
Discussion
في العقد الماضي، شهدت التلاعب وتقنيات التصوير جزيء واحد تقدما كبيرا من حيث القرار المكانية والزمانية. الجمع بين تقنيات التصوير والتلاعب هو في القاعدة من الأدوات القوية التي تسمح الآن لسيطرة الظروف الميكانيكية للبوليمر بيولوجي واحد، مثل DNA، RNA أو هيكل الخلية خيوط، و?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر جيس Wuite، إروين JG بيترمان، وبيتر الإجمالي للمساعدة مع على microfluidics وأليسيا Tempestini للمساعدة في إعداد العينات. وقد تم تمويل هذا البحث من قبل البرنامج الإطاري السابع للاتحاد الأوروبي (FP7 / 2007-2013) تحت اتفاقية المنحة رقم 284464 والإيطالية من وزارة التعليم والجامعات والبحوث FIRB 2011 RBAP11X42L006، فوتورو في يسر كل من Ricerca RBFR13V4M2 2013، وفي إطار الرائد مشروع NANOMAX.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
