タンパク質-DNA相互作用の研究のための単一分子マニピュレーションとイメージングを組み合わせる
Summary
ここでは、二枚の光学トラップされたマイクロスフェアの間に懸架単一のDNA分子と相互作用する単一の蛍光標識タンパク質分子を検出するための機器および方法が記載されている。
Abstract
The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.
Introduction
単一分子（SM）の技術が大幅に伝統的な、バルク溶液の測定1-3のいくつかの制限を克服する必要性に対応するために、過去30年にわたって開発してきた。単一の生物学的分子の操作は、バイオポリマー4の機械的特性を測定し、タンパク質-タンパク質5およびタンパク質-DNA相互作用6,7の機械的パラメータを制御する機会を作成した。 SMの蛍光検出は、一方で、ナノメートルの精度で単一分子を局在化および追跡の可能性をもたらす、 インビトロおよびインビボでのタンパク質活性を研究するための驚くほど用途の広いツールを表す。 SM画像に器具点広がり関数のフィッティングを介して、実際には、一方が信号対雑音比（SNR）に主に依存し、約1ナノメートル8,9の限界に達し精度で局在化を達成することができる。これらの方法論は強力見つけるモータータンパク質のダイナミクスの研究においてだけでなく、DNA結合タンパク質におけるターゲット探索の基礎となる拡散プロセスのアプリケーションに最適です。ターゲット上のDNA配列の機能、滞留時間などの拡散定数を決定し、正確に一次元拡散イベント中探求DNAの長さを測定する能力は、タンパク質-DNA相互作用の動力学の研究のための調査のための強力なツールを表す特定のターゲット探索のメカニズム。
最近では、これら2つの技術の組み合わせは、例えば、生物学的基質（例えば、アクチンフィラメント又はDNA分子）と相互作用パートナー酵素の検出/局在化（同時操作を可能にする実験装置10-14の新世代を生産しているミオシンまたはDNA結合タンパク質）。これらの技術の利点は、主にENAしたがって、捕捉されたポリマー上の機械制御を発揮する可能性に載る力又はトルクに対する相互作用のダイナミクスの研究をブリンブリン。また、方法は、古典的なSM方式、 すなわち、表面上の研究中の分子の固定化のための必要性（ガラススライドまたはマイクロスフェア）の主な制限の一つを避け、表面から遠い生化学的反応を測定することができる。
2単一分子技術の組み合わせは、15（nmの精度でローカライズが必要な場合は特に）は、主に機械的安定性および十分なSNRの要件に起因する、いくつかの技術的困難を克服する必要があります。特に、ノイズの低減を光ピンセットとSMの蛍光検出を結合し、捕捉赤外線レーザー16および生物学的複合体11が最重要である実験的測定の性能の組み立てのための生化学的なバッファのコントロールから光退色する。ここでは、正常に実行するための方法を記載デュアルトラップ/ SM蛍光ローカライズセットアップでの測定値。方法は、（Atto532付き）ラクトースリプレッサータンパク質（LacIリ）蛍光標識の例に示されており、それは、特定のLacI結合配列（ すなわち、オペレータ）を含有する（二つの光ピンセットの間に閉じ込められた）DNA分子に結合するとして検出される。私たちは、ターゲット検索処理においてその輪郭に沿ってDNAと拡散のLacIの結合を検出する方法の有効性を示す。この方法は、DNA配列およびDNA結合タンパク質の任意の組み合わせの、並びに他のシステム（または微小管アクチンフィラメント及びそれらと相互作用するモータータンパク質）にも適用可能である。
Protocol
Representative Results
Discussion
過去10年間で、単一分子マニピュレーションとイメージング技術は、空間および時間解像度の面で大きな進歩を見てきました。操作およびイメージング技術の組み合わせは、現在では、DNA、RNA、または細胞骨格フィラメントとして単一の生物学的ポリマーの機械的条件の制御を可能にする強力な器具のベースと、同じポリマーと相互作用する単一のタンパク質の同時局在化である。閉じ込め?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、サンプル調製のヘルプのためのマイクロ流体とアレッシアTempestiniのヘルプはハイス·Wuite、アーウィンJGピーターマン、ピーターグロスに感謝します。本研究は、n 284464を°とRicerca 2013 RBFR13V4M2教育、大学·研究FIRB 2011 RBAP11X42L006、フトゥロイタリア省から、との枠組みの中でグラント契約の下で、欧州連合（EU）セブンス枠組み計画（FP7 / 2007年から2013年）によって賄われていたフラッグシップ·プロジェクトNANOMAX。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description | Web Address |
| elastomeric isolators | Newport | Newdamp | Choose the appropriate Newdamp elastomer depending on the microscope weight and resonance frequencies | http://www.newport.com |
| optical isolator | Optics for Research | IO-3-YAG-VHP | http://www.ofr.com | |
| Nd:YAG laser, 1064 nm wavelength | Spectra-Physics | Millennia IR | http://www.newport.com/ | |
| acousto-optic deflectors (AODs) | A&A optoelectronic | DTS-XY 250 | http://www.aaoptoelectronic.com/ | |
| Direct Digital Synthesizers | Analog Devices | http://www.analog.com/ | ||
| quadrant detector photodiodes | OSI optoelectronics | SPOT-15-YAG | http://www.osioptoelectronics.com | |
| DIO and FPGA board | National Instruments | NI-PCI-7830R | http://www.ni.com | |
| Halogen lamp | Schott | KL 1500 LCD | http://www.schott.com | |
| Condenser | Olympus | U-AAC 1.4NA Aplanat Apchromat | http://www.olympus-global.com/en/ | |
| Objective | Nikon | CFI Plan Apochromat 60x 1.2NA water immersion | http://www.nikoninstruments.com | |
| 532 nm laser | Coherent | Sapphire | http://www.coherent.com | |
| CCD 200X and 2000X | Hamamatsu | XC-ST70 CE | http://www.hamamatsu.com | |
| electron-multiplied CCD | Hamamatsu | C9100-13 | http://www.hamamatsu.com/ | |
| piezo stage with nm-accuracy | Physik Instrumente | P-527.2CL | http://www.physikinstrumente.com/ | |
| Emission Filter | Chroma Technologies | 600/100m | http://www.chroma.com | |
| silica beads (1.54 mm) | Bangs Laboratories | SS04N/5303 | http://www.bangslabs.com/ | |
| Albumin from bovine serum (BSA) | Sigma Aldrich | B4287 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| pentyl acetate | Sigma Aldrich | 46022 | Flammable liquid and vapour (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| nitrocellulose | Sigma Aldrich | N8267-5EA | Flammable solid (No 1272/2008) | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| heat block | MPM Instruments Srl | M502-HBD | with 2 removable blocks; preheated at 120° C | http://www.mpminstruments.com |
| NanoPort assemblies | Upchurch Scientific Inc. | N-333 | http://www.upchurch.com/ | |
| polyetheretherketone tubing | Upchurch Scientific Inc. | 1535 | http://www.upchurch.com/ | |
| home-made metallic holder for the assembly of the flow-chamber pressure reservoir made of Plexiglass | ||||
| luer lock-tip syringes 2.5 mL | Terumo | SS 02LZ1 | http://www.terumomedical.com | |
| shut-off valves | Upchurch Scientific, Inc. | P-732 | http://www.upchurch.com/ | |
| flangeless fittings | Upchurch Scientific, Inc. | LT-111 | http://www.upchurch.com/ | |
| fluorinated ethylene propylene tubing | Upchurch Scientific, Inc. | 1549 | http://www.upchurch.com/ | |
| two computer-controlled solenoid valves | Clippard, Cincinnati, USA | ET-2-H-M5 | http://www.clippard.com | |
| pressure transducer | Druck LTD | PTX 1400 | ||
| biotin-14-dCTP | Life Technologies | 19518-018 | http://www.lifetechnologies.com/ | |
| Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) | Thermoscientific | EP0161 | http://www.thermoscientificbio.com/ | |
| ATTO532 maleimide | Sigma Aldrich | 68499 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| N,N-dimethylformamide (DMF) | Sigma Aldrich | 227056 | Combustible Liquid, Harmful by skin absorption., Irritant, Teratogen. H226; H303; H312; H316; H319; H331; H360; P201; P261; P280;P305; P351; P338; P311 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Tris-(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) | Sigma Aldrich | C4706 | http://www.sigmaaldrich.com/ | |
| L-Glutathione reduced (GSH) | Sigma Aldrich | G4251 | Acute toxicity, Oral (Category 5), H303 | http://www.sigmaaldrich.com/ |
| Amicon Ultra-15, PLQK Ultracel-PL Membrane, 10 kDa cutoff spin concentrators | Merck Millipore | UFC901024 | http://www.merckmillipore.it/ | |
| streptavidin-coated polystyrene beads 1,87 µm | Spherotech, Inc. | SVP-15-5 | http://www.spherotech.com/ |
References
- Monico, C., Capitanio, M., Belcastro, G., Vanzi, F., Pavone, F. S. Optical Methods to Study Protein-DNA Interactions in Vitro and in Living Cells at the Single-Molecule Level. International journal of molecular sciences. 14, 3961-3992 (2013).
- Tinoco, I., Gonzalez, R. L. Biological mechanisms, one molecule at a time. Genes & development. 25, 1205-1231 (2011).
- Capitanio, M., et al. Exploring molecular motors and switches at the single-molecule level. Micr. Res. Tech. 65, 194-204 (2004).
- Smith, S. B., Finzi, L., Bustamante, C. Direct mechanical measurements of the elasticity of single DNA molecules by using magnetic beads. Science. 258, 1122-1126 (1992).
- Block, S. M., Goldstein, L. S., Schnapp, B. J. Bead movement by single kinesin molecules studied with optical tweezers. Nature. 348, 348-352 (1990).
- Wang, M. D., et al. Force and velocity measured for single molecules of RNA polymerase. Science. 282, 902-907 (1998).
- Capitanio, M., et al. Ultrafast force-clamp spectroscopy of single molecules reveals load dependence of myosin working stroke. Nat Methods. 9, 1013-1019 (2012).
- Thompson, R. E., Larson, D. R., Webb, W. W. Precise nanometer localization analysis for individual fluorescent probes. Biophys J. 82, 2775-2783 (2002).
- Yildiz, A., et al. Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization. Science. 300, 2061-2065 (2003).
- Biebricher, A., Wende, W., Escude, C., Pingoud, A., Desbiolles, P. Tracking of single quantum dot labeled EcoRV sliding along DNA manipulated by double optical tweezers. Biophys J. 96, 50-52 (2009).
- Candelli, A., Wuite, G. J., Peterman, E. J. Combining optical trapping, fluorescence microscopy and micro-fluidics for single molecule studies of DNA-protein interactions. Physical chemistry chemical physics : PCCP. 13, 7263-7272 (2011).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Continuous and time-shared multiple optical tweezers for the study of single motor proteins. Optics and Lasers in Engineering. 45, 450-457 (2007).
- Harada, Y., et al. Single-molecule imaging of RNA polymerase-DNA interactions in real time. Biophys J. 76, 709-715 (1999).
- van Mameren, J., et al. Counting RAD51 proteins disassembling from nucleoprotein filaments under tension. Nature. 457, 745-748 (2009).
- Capitanio, M., Maggi, D., Vanzi, F., Pavone, F. Fiona in the trap: the advantages of combining optical tweezers and fluorescence. J Opt A: Pure Appl Opt. 9, s157 (2007).
- Dijk, M. A., Kapitein, L. C., Mameren, J., Schmidt, C. F., Peterman, E. J. Combining optical trapping and single-molecule fluorescence spectroscopy: enhanced photobleaching of fluorophores. J Phys Chem B. 108, 6479-6484 (2004).
- Capitanio, M., Cicchi, R., Pavone, F. S. Position control and optical manipulation for nanotechnology applications. European Physical Journal B. 46, 1-8 (2005).
- Capitanio, M., et al. Calibration of optical tweezers with differential interference contrast signals. Review of Scientific Instruments. 73, 1687-1696 (2002).
- Elangovan, R., et al. An integrated in vitro and in situ study of kinetics of myosin II from frog skeletal muscle. J Physiol. 590, 1227-1242 (2012).
- Wuite, G. J. L., Davenport, R. J., Rappaport, A., Bustamante, C. An integrated laser trap/flow control video microscope for the study of single biomolecules. Biophysical Journal. 79, 1155-1167 (2000).
- Brewer, L. R., Bianco, P. R. Laminar flow cells for single-molecule studies of DNA-protein interactions. Nat Methods. 5, 517-525 (2008).
- Rutkauskas, D., Zhan, H. L., Matthews, K. S., Pavone, F. S., Vanzi, F. Tetramer opening in LacI-mediated DNA looping. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 16627-16632 (2009).
- Marko, J. F., Siggia, E. D. Stretching DNA. Macromolecules. 28, 8759-8770 (1995).
- van Mameren, J., et al. Unraveling the structure of DNA during overstretching by using multicolor, single-molecule fluorescence imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 18231-18236 (2009).
- Wang, M. D., Yin, H., Landick, R., Gelles, J., Block, S. M. Stretching DNA with optical tweezers. Biophys J. 72, 1335-1346 (1997).
- Ma, H., Long, F., Zeng, S., Huang, Z. L. Fast and precise algorithm based on maximum radial symmetry for single molecule localization. Opt Lett. 37, 2481-2483 (2012).
- Parthasarathy, R. Rapid, accurate particle tracking by calculation of radial symmetry centers. Nat Methods. 9, 724-726 (2012).
