Visualisation des Endosome Dynamics dans Vivre terminaisons nerveuses avec quatre dimensions d'imagerie par fluorescence
Summary
Quatre dimensions (4D) imagerie est utilisée pour étudier le comportement et les interactions entre les deux types de endosomes dans les terminaisons nerveuses vertébrés vivant. Le mouvement de ces petites structures est caractérisé en trois dimensions, ce qui permet la confirmation des événements tels que la fusion des endosomes et l'exocytose.
Abstract
Quatre dimensions (4D) Imagerie de la lumière a été utilisé pour étudier le comportement des petites structures au sein terminaisons nerveuses motrices de la transverse de l'abdomen mince muscle de la couleuvre rayée. Les données brutes comprend des séquences de time-lapse de 3D z-piles. Chaque pile contient 4-20 images acquises avec une optique à épifluorescence à plans focaux séparés par 400-1,500 nm. Les étapes de l'acquisition de piles d'images, telles que le réglage de mise au point, la commutation de longueurs d'onde d'excitation, et le fonctionnement de l'appareil photo numérique, sont automatisées autant que possible pour maximiser le taux d'image et de minimiser les dommages aux tissus exposés à la lumière. Après l'acquisition, une série de piles d'images est une déconvolution pour améliorer la résolution spatiale, converties au format 3D désirée, et sert à créer un "film" 4D qui est appropriée pour diverses analyses sur ordinateur, en fonction des données expérimentales recherchées. Une application est l'étude du comportement dynamique de deux classes de endosomes trouvés dans nerveuses bornes-macroendosomes (ME)et endosomes acides (EI)-dont la taille (200-800 nm pour les deux types) sont à ou près de la limite de diffraction. Accès à l'information 3D à chaque point de temps offre plusieurs avantages par rapport à l'imagerie time-lapse classique. En particulier, la taille et la vitesse de déplacement de structures peuvent être quantifiés dans le temps sans perte de netteté. Des exemples de données de l'imagerie 4D montrent que les ME se rapprochent de la membrane plasmique et disparaissent, ce qui suggère qu'ils sont exocytosed plutôt que de déplacer simplement verticalement à une distance à partir d'un seul et même plan de mise au point. Est également révélé fusion putatif de ME et EI, par visualisation de chevauchement entre les deux structures contenant un colorant telles que vues dans chacune des trois projections orthogonales.
Introduction
Imagerie time-lapse de tissu vivant offre un accès visuel à dynamiques des relations structure-fonction qui ne peut être apprécié dans les préparations fixes ou vivant imagées en un seul point dans le temps. Souvent, cependant, l'arbitrage pour l'accès à l'information temporelle est une diminution de la résolution optique. Ouverture numérique des objectifs élevés huile d'immersion ne sont pas pratiques dans les tissus vivants en raison de leur gamme étroite de mise au point, laissant immersion dans l'eau ou les objectifs secs comme les seules alternatives. En outre, la résolution accrue offerte par l'optique confocale ne peut pas être utilisée dans certaines préparations de vie en raison de la phototoxicité des niveaux relativement élevés d'éclairement requis de 1,2. Enfin, alors que plusieurs techniques optiques en temps réel ou en accéléré sont disponibles qui offrent résolution améliorée, leur applicabilité est limitée aux préparations où les structures d'intérêt peuvent être positionnés à quelques centaines de nanomètres de l'objectif 1. La méthode décriterend l'utilisation de l'équipement relativement peu coûteux, est polyvalent, tout en offrant une meilleure résolution par rapport aux techniques time-lapse plus couramment utilisés. Il est destiné à être utilisé dans les laboratoires individuels ainsi que des installations d'imagerie.
Le procédé utilise la microscopie à épifluorescence classique, combiné avec un appareil photo numérique sensible et avec du matériel destiné à acquérir rapidement des ensembles d'images légèrement différentes plans focaux (z-piles). Chaque z-stack est numériquement deconvolved pour augmenter la résolution. Une caractéristique de la 3D time-lapse (4D) imagerie est suivi précis des organites ou d'autres structures en mouvement. Lorsqu'il est correctement mis en place, les structures imagées ne sortent pas de mise au point, et le mouvement dans les trois directions peuvent être observés et quantifiés. Ainsi, il est impossible pour une structure teinté à disparaître sur un ou plusieurs cadres time-lapse seulement par la dérive au-dessus ou en dessous d'un plan focal étroit. La méthode est aussi un outil sensible pour évaluer les interactions et possible fusion de petites structures. Épifluorescence classique ou images confocales de structures proches de la limite de diffraction (quelques centaines de nm) ne confirment pas la fusion même si les images fusionnées montrent chevauchement de leurs étiquettes respectives 3. Fusion est suggéré, mais il reste possible que les objets sont séparés horizontalement et verticalement par une distance qui est inférieure à la limite de diffraction. Trois ou à quatre dimensions imagerie, en revanche, permet la visualisation des objets dans chacune des trois directions orthogonales. L'apparition de la fusion dans les trois vues augmente le niveau de sécurité. Et, dans certaines préparations de vie, la direction ou le mouvement brownien des objets présumément fusionnés fournit une preuve supplémentaire lorsque les deux étiquettes se déplacent ensemble dans le temps. Bien sûr, quand près de la limite de diffraction du niveau de certitude dans les structures les plus exigeants de fond, ou montrant qu'ils contiennent deux colorants (fusion), n'est pas absolue. Le cas échéant, des techniques spécialisées, telles que le transfert d'énergie par résonance de fluorescence (FRET)4, sont plus appropriées.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'aspect le plus critique de l'imagerie 4D est la gestion de la durée et de l'intensité de l'exposition de la lumière. Photoblanchiment d'image diminue le rapport signal-sur-bruit et peut être problématique ou non en fonction de divers facteurs, y compris le choix des fluorophores. Non spécifique des dommages aux tissus vivants (de phototoxicité) est liée au photoblanchiment, et peut parfois être identifiée en utilisant des sondes fluorescentes conçus à cet effet ou 2,12 par ex…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les US National Institutes of Health Grant NS-024572 (à RSW).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
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