ויזואליזציה של Endosome Dynamics בחי מסוף עצב עם דימות פלואורסצנטי ארבעה ממדים
Summary
הדמיה ארבעה ממדים (4D) מנוצל כדי ללמוד את ההתנהגות ואינטראקציות בין שני סוגים של endosomes בחיים מסוף עצב חוליות. תנועה של המבנים הקטנים האלה מתאפיינת בשלושה ממדים, המאפשרת אישור של אירועים כגון היתוך endosome וexocytosis.
Abstract
ארבעה ממדים (4D) אור הדמיה נעשתה שימוש כדי ללמוד את ההתנהגות של מבנים קטנים בתוך מסוף עצב המוטורי של transversus abdominis שריר הרזה של נחש הבירית. הנתונים גולמיים כוללים רצפים של Z-ערימות 3D זמן לשגות. כל ערימה מכילה 4-20 תמונות שנרכשו עם אופטיקה epifluorescence במטוסי מוקד מופרדים על ידי 400-1,500 ננומטר. שלבים ברכישת ערימות של תמונות, כגון התאמה של מיקוד, מיתוג של אורכי גל עירור, ותפעול של המצלמה הדיגיטלית, הם אוטומטיים ככל האפשר על מנת למקסם את קצב תמונה ולמזער את הנזק לרקמות כתוצאה מחשיפה לאור. לאחר רכישה, קבוצה של ערימות תמונה deconvolved כדי לשפר את הרזולוציה מרחבית, שהומר לפורמט 3D הרצוי, ומשמש ליצירה "סרט" 4D כי הוא מתאים למגוון רחב של ניתוחים מבוססי מחשב, בהתאם לנתונים הניסיוניים ביקשו. יישום אחד הוא מחקר של ההתנהגות הדינמית של שתי מעמדות של endosomes מצאו במסופים-macroendosomes עצב (MES)וendosomes חומצי (AES), שגדלים (200-800 ננומטר עבור שני הסוגים) הן ליד או לגבול ההשתברות. גישה למידע 3D בכל נקודת זמן מספקת מספר יתרונות על פני הזמן לשגות הדמיה קונבנציונלית. בפרט, גודל ומהירות תנועה של מבנים ניתן לכמת לאורך זמן ללא אובדן המיקוד חד. דוגמאות לנתונים מהדמית 4D עולים כי MES ניגש קרום הפלזמה ונעלמים, מה שמרמז שהם exocytosed ולא רק נעים אנכי ממישור אחד של מוקד. חשף גם הוא היתוך משוער של MES ו-AES, על ידי הדמיה של חפיפה בין שני המבנים המכיל צבען כפי שנצפו בכל שלוש תחזיות המאונכות.
Introduction
זמן לשגות הדמיה של רקמת חיה מספקת גישה חזותית ליחסי תפקוד והמבנה דינמיים, שלא ניתן להערכה בהכנות קבועות או חיים צילמו בנקודה אחת בזמן. לעתים קרובות, עם זאת, שהתגמול עבור גישה למידע זמני הוא ירידה ברזולוציה אופטית. מטרות נפט טבילה צמצם מספרי גבוהה הן מעשיות ברקמת חיה בגלל הטווח הצר שלהם בפוקוס, והשאירו את הטבילה במים או מטרות יבשות כחלופות בלבד. יתר על כן, ברזולוציה המוגברת המוענקת על ידי אופטיקה confocal לא יכולה להיות מנוצל בכמה הכנות חיים בשל phototoxicity מהרמות גבוהות היחסי של תאורה הנדרשת 1,2. לבסוף, בעוד כמה שיטות אופטיות בזמן אמת או זמן לשגות זמינות שרזולוציה משופרת ההצעה, תחולתם מוגבלת להכנות שבו מבנים של עניין יכולים להיות ממוקמות בתוך כמה מאה ננומטרים של המטרה 1. השיטה המתוארתעושה שימוש בציוד בעלות נמוכה יחסית, הוא תכליתי, ובכל זאת מציעה רזולוציה משופרת בהשוואה לטכניקות זמן לשגות יותר נפוץ בשימוש. הוא מיועד לשימוש במעבדות בודדות, כמו גם מתקני הדמיה.
השיטה משתמשת במיקרוסקופ epifluorescence קונבנציונלי, בשילוב עם מצלמה דיגיטלית רגישה ועם חומרה שנועדה לרכוש במהירות סטים של תמונות במישורים שונים מעט מוקד (Z-ערימות). כל Z-מחסנית היא deconvolved דיגיטלי כדי להגדיל את הרזולוציה. תכונה אחת של 3D הדמיה זמן לשגות (4D) היא מעקב מדויק של העברת אברונים או מבנים אחרים. כאשר להגדיר כראוי, מבנים צילמו לא לצאת מפוקוס, ותנועה בכל שלושת הכיוונים ניתן להבחין ולכמת. לכן זה בלתי אפשרי עבור מבנה מוכתם להיעלם מעל מסגרות זמן לשגות אחד או יותר רק על ידי היסחפות מעל או מתחת למישור מוקד צר. השיטה משמשת גם ככלי רגיש להערכת האינטראקציות ופו האפשרישיאון של מבנים קטנים. epifluorescence הקונבנציונלי או תמונות confocal של מבנים סמוכים לגבול ההשתברות (כמה מאה ננומטר) לא לאשר מיזוג גם אם תמונות התמזגו להראות חפיפה של התוויות שלהם 3. היתוך הוא הציע, אבל זה עדיין אפשרי שהאובייקטים מופרדים אופקי או אנכי על ידי מרחק שהוא מתחת לגבול ההשתברות. שלוש או הדמיה ארבעת ממדים, לעומת זאת, מאפשרת צפייה באובייקטים בכל אחד משלושה כיוונים מאונך. המראה של היתוך בכל שלוש התצוגות מגדיל את רמת הוודאות. וגם, בכמה הכנות חיים, בבימוי או תנועה הבראונית של אובייקטים התמזגו putatively מספקת הוכחה נוספת, כאשר שני התוויות לנוע יחד בזמן. כמובן, כאשר סמוך לגבול השתברות רמת הוודאות במבני הבחנה מהרקע, או שמראה שהם מכילים שני צבעים (היתוך), אינה מוחלטת. אם טכניקות ישימות, מיוחדות, כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג)4, הם מתאימים יותר.
Protocol
Representative Results
Discussion
ההיבט הקריטי ביותר של ההדמיה 4D הוא ניהול של המשך ועוצמת חשיפה לאור. Photobleaching יורד יחס אות לרעש בתמונה ויכול להיות בעייתי או לא תלוי בגורמים שונים, לרבות בחירה של fluorophores. נזק ספציפי לרקמת חיה (phototoxicity) קשור לphotobleaching, ולעתים ניתן לזהות באמצעות בדיקות ניאון נועדו למטרה 2…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכון הלאומי האמריקאי לבריאות גרנט NS-024,572 (לRSW).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
- Tinevez, J. -. Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
- Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
- Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late” macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
- Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
- Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).
- Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
- Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
- Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).
