في المختبر تجميع فحوصات عن طريق Hyperphosphorylated تاو البروتين
Summary
واستخدمت البروتينات تاو معدلة وhyperphosphorylated في اثنين من فحوصات في المختبر تجميع للكشف عن حركية تجميع سريع تعتمد على hyperphosphorylation. هذه المقايسات تمهد الطريق لشاشات المستقبلية للمركبات التي يمكن أن تعدل بميل تاو hyperphosphorylated لتشكيل الألياف التي تكمن وراء تطور مرض الزهايمر.
Abstract
Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.
Introduction
مرض الزهايمر (AD) هو واحد من مجموعة كبيرة من الاضطرابات العصبية المعروفة باسم tauopathies. في الجوهر tauopathy علم الأمراض الكامنة هو التشابك الليفي العصبي، NFTS، في الخلايا العصبية، الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة 1-4. كثافة NFT يرتبط مع ضعف الادراك 3،5 والخلايا العصبية وفقدان 6. NFT يحتوي على بروتين تاو hyperphosphorylated في المقام الأول (المشار إليها باسم "P-تاو" من الآن فصاعدا) التي تشكل خيوط مستقيمة أو حلزونية تقرن (PHF) 7،8. تاو هو بروتين يرتبط أنيبيب يعتقد لتسهيل النقل المحاور التي لا غنى عنها للإشارات العصبية والاتجار 9،10. كل جزيء تاو يحتوي على 2 إلى 3 الفوسفات في الدماغ العادي، ولكن زيادة المحتوى فسفوريل عدة طيات في المرضى الذين tauopathy 11. من المحتمل أن تساهم في تاو hyperphosphorylation بما في ذلك GSK3β (الجليكوجين سينسيز كيناز 3β) وCDK5 (السيكلين دي تحركات متعددةكيناز معلقة 5) 12،13، ولكن على الزناد المباشر للالفسفرة المرضية لا يزال بعيد المنال 14. الفسفرة غير طبيعية في أو بالقرب من الزخارف ملزم أنيبيب تنأى تاو من أنيبيب 15، ويسبب تاو سوء الترجمة إلى المقصورة somatodendritic، حيث oligomerizes ف تاو إلى خيوط مستقيمة أو حلزونية تقرن التي يمكن أن تتبلمر في نهاية المطاف إلى الادراج NFT. أدى التعادل وثيق بين hyperphosphorylation تاو، وتشكيل NFT، والتنكس العصبي إلى فرضية السائدة التي التشابك ف تاو الحصول على ردود السامة للخلايا أفكارك وغيرها، وبالتالي هي السبب الكامن وراء tauopathy تنكس عصبي 16،17. تم إطلاق شاشات المخدرات والاختبارات السريرية في وقت مبكر على أساس هذا الافتراض 18. ومع ذلك، تواجه هذه الفرضية التحديات 19،20. على سبيل المثال، سانتا كروز وآخرون أظهرت أن الوظائف المعرفية من الفئران المعدلة وراثيا يمكن أن تتحسن عن طريق قمع التعبير عن المسختاو البشري، على الرغم من استمرار NFTS لتشكيل جزيئات من تاو القائمة 21. في نموذج ذبابة الفاكهة، فقد تبين NFT لعزل وعصاري خلوي تاو السامة لحماية الخلايا العصبية الكامنة 22،23. ومن الواضح أن دور التسبب في NFT، إن وجدت، سوف تؤثر بشكل كبير على اتجاه التنمية العلاجات tauopathy.
في تركيزات عالية، المؤتلف أو العادي بروتين تاو الدماغ بشكل عفوي ولكن ببطء يبلمر إلى بنية تشبه PHF في المختبر، كما يتبين من ربط عدة ورقة β فضل الأصباغ الفلورية، المجهر الإلكتروني، وتشتت الضوء الطيفي 24-27. مضيفا الهيبارين أو حمض الأراكيدونيك، وهو من الأحماض الدهنية وفرة في دماغ الإنسان، ويسرع بشكل كبير في تشكيل PHF isoform- تاو ومحفز تعتمد على التركيز الخلق 28-32. يثير الاهتمام والفضول، تنقية تاو hyperphosphorylated من أدمغة AD أو عن طريق شاملة أعدت في تفاعلات الفسفرة المختبر لggregates أسرع وأكثر كفاءة 26،33-35. هذه النتائج هي في الاتفاق ممتازة مع الأدوار المرضية للف تاو. وبالتالي يجوز للنظام في المختبر على أساس تجميع ف تاو بمثابة أداة قوية لفحص AD المخدرات.
ونظرا لارتباط وثيق بين تجميع تاو والتنكس العصبي التدريجي للم، وكذلك فشل الأخير في تطوير العقاقير التي تستهدف وحة Aβ، علامة أخرى النسيجية الرئيسية 36-38 م، والفائدة في اكتشاف العقاقير التي تتحكم تاو تجميع آخذ في الارتفاع. في الواقع، العديد من الجماعات قد بدأت بالفعل شاشات المخدرات في الإنتاجية المختلفة، وذلك باستخدام المختبر في ردود الفعل تاو التجميع كما الفحص الابتدائي. تم العثور على عدد من المواد الكيميائية لعرض الأنشطة المثبطة أو انعكاس على تاو التجميع في المختبر 39-42. ومع ذلك، كل الشاشات الحالية منظم تاو تاو تجميع تستخدم معدلة أن يفتقد العلامة المرضية الرئيسية من الفوسفورylation، ورفع مصدر قلق لخصوصية وفعالية استخدام هذه المركبات في علاج م.
واحدة من العقبات الرئيسية لتطوير المقايسات تجميع لتوصيف والكيمياء الحيوية وفحص AD المخدرات هو إنتاج كميات كافية من البروتين تاو hyperphosphorylated ذات الصلة pathophysiologically. باستخدام نظام الحفز سحابات بمساعدة الذي شكل الإسوي 1N4R من تاو وكيناز GSK-3β وشارك أعرب في E. القولونية كما يسين سستة البروتينات الانصهار، وتغلبنا على هذا التحدي (. سوي وآخرون، المقدمة؛ انظر الشكل 1 للمنتجات النهائية تاو وف تاو، انظر أيضا 43 لأولي الشامل توصيف الطيف من ص-تاو). من لجنة من تسعة أجسام مضادة محددة لمواقع الفسفرة مختلفة من تاو، وشوهدت إشارات إيجابية في ثمانية مواقع (لا تظهر البيانات). أدناه، وصفنا البروتوكولات وأدوات القياس التي يمكن أن تفرق تجميع د الحركيifferences بين تاو معدلة والأنواع ف تاو. تم تعديل هذه المقايسات من البروتوكولات نشرت أن تقاس زيادة مضان من thioflavin T (تى اتش تى) أو thioflavin S (تي إتش إس) عند اميلويد (المجاميع تاو) ملزمة 26. في أول "محطة"، نهج لا صبغ، يتم تجميع ردود الفعل تجميع وحضنت في غياب الصبغة اميلويد. في نقاط زمنية مختلفة، تتم إزالة قسامة من كل رد فعل ومختلطة مع حجم مساو من المخزن المؤقت تى اتش تى التي تحتوي على وقف التجميع والسماح تى اتش تى لربط المجاميع تاو. ويقاس مضان من قبل IAP FluoroMax-2 التألق. في المجموعة الثانية "مع صبغ" مراقبة الفحص المستمر، يتم تضمين تى اتش تى أو تي إتش إس في ردود الفعل التجميع. ويمكن قياس مضان باستمرار طوال التجربة بأكملها يدويا أو باستخدام قارئ لوحة متعددة. وبالإضافة إلى ذلك، نحن تصف مقايسة يستخدم تركيز شبه الفسيولوجية من تاو وف تاو للتجميع في مو قياس مستمردي. تأثير الفسفرة يبقى كشفها بسهولة. أدناه، فإننا سوف تصف الإجراءات العملية خطوة بخطوة، وتظهر نتائج ممثلة من هذه المقايسات. سوف مناقشة بعض من إيجابيات وسلبيات كل نهج، فضلا عن التطبيقات المحتملة متابعة فحص المخدرات.
بتركيز عال، تاو المجاميع في هياكل تشبه اميلويد من تلقاء أنفسهم. ومع ذلك، في المختبر، وعادة ما تسارع تاو fibrillization من هذه المحرضات كما الهيبارين (متوسط الوزن الجزيئي، 6،000 جم / مول) وحمض الأراكيدونيك. الأمثلة الموضحة في هذه الوثيقة تتضمن 30 ميكرومتر الهيبارين. ويتم رصد تشكيل تاو المجاميع اميلويد من قبل مضان الناتجة عن اميلويد ملزمة thioflavin T (تى اتش تى) أو thioflavin S (تي إتش إس). على ملزم لالمجاميع تاو، تى اتش تى يسلك التحول الأحمر في مضان (الإثارة: 450 نانومتر؛ الانبعاثات ذروتها: 485 نانومتر). تي إتش إس، من ناحية أخرى، لديها ضعف الانبعاثات في 510 نانومتر (الإثارة في 450 نانومتر) قبل اميلويد ملزمة، ولكن هذا fluorescencزيادات الإلكترونية بشكل كبير في وجود بروتين اميلويد مثل تاو مجمعة 44. كلا الأصباغ تعمل بشكل جيد في الكشف عن تاو وف تاو التجميع. بسبب ذروة الانبعاثات قوية واسعة نسبيا من تى اتش تى (انظر الشكل 2)، وهناك فقط 30٪ تخفيض في وحدة مضان في 510 نانومتر. للراحة، ونحن نستخدم نفس مزيج من موجات الإثارة / الانبعاثات (أي 450 نانومتر / 510 نانومتر) لمراقبة تاو تجميع عند استخدام إما صبغ.
ويمكن أن يتم تجميع تاو في وجود أو عدم وجود الصبغة، وهذا يتوقف على الغرض من الفحص وتوافر البروتين تاو. وتظهر كل من وسائط من ردود الفعل أدناه. وبالإضافة إلى ذلك، ونحن لشرح تشغيل اثنين من الأدوات المختلفة – مقياس التألق عينة واحدة (ISA-سبكس FluoroMax-2) وقارئ متعدد لوحة (SpectraMax M2). وينبغي أن تكون قادرة على التكيف مع هذه البروتوكولات لتناسب احتياجاتهم الخاصة وتوفر أداة القراء.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول يوضح شروط الفحص المختلفة والأدوات التي كشف تاو سريع حركية التجميع التي تعتمد على الفسفرة. في مقايسة المحطة، يتم إضافة الصبغة مضان تى اتش تى لجزء من رد فعل إزالتها من مزيج الرئيسي في كل نقطة زمنية. اميلويد يسببها ملزم ثم يقاس مضان 26. في المجموعة ال?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15576-028 | |
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | Stored in dark |
| Thioflavin S | Sigma | T1892 | Stored in dark |
| heparin | Sigma | H3393 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | Stored at 4°C |
| 96-well plate | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader | Molecular Devices | ||
| Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody | R&D Systems | MAB3494 | Stored at –80° |
References
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
- Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer’s disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
- Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
- Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
- Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer’s and Parkinson’s disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
- Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
- Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer’s disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
- Bamburg, J. R., Bloom, G. S. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (8), 635-649 (2009).
- Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
- Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
- Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
- Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
- Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437 (2011).
- Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247 (2012).
- Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
- Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
- Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
- SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Génétique. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
- Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
- Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
- Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochimie. 46 (30), 8838-8849 (2007).
- Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
- King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
- Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer’s disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
- Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
- Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer’s disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
- Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer’s paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
- Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
- Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
- Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
- Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
- Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
- Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
- DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3′ overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
- Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochimie. 46 (12), 3856-3861 (2007).
- Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochimie. 46 (35), 10016-10023 (2007).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12 (2007).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Herrup, K. Reimagining Alzheimer’s disease–an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
- Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
- Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79 (2013).
