In Vitro toplama Deneyler hiperfosforile tau proteini kullanılarak
Summary
Değiştirilmemiş ve hiperfosforile tau proteinleri hiperfosforizasyonu bağımlı hızlı agregasyon kinetiğini ortaya çıkarmak için, iki in vitro toplanma deneylerde kullanıldı. Bu deneyler Alzheimer hastalığının ilerlemesini altında yatan fibriller oluşturmak için hiperfosforilize tau eğilimini modüle edebilir bileşikler için gelecek ekranlar için önünü.
Abstract
Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.
Introduction
(AD), Alzheimer hastalığı tauopatıler olarak bilinen nörodejeneratif hastalıkların geniş bir koleksiyon biridir. Özetin özeti patoloji yatan tauopathy nöronlar, astrositler ve mikroglia 1-4 nörofibrillerin, NFTler vardır. NFT yoğunluk kognitif bozukluk 3,5 ve nöron kaybı 6 ile ilişkilidir. NFT düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanların (PHF) 7,8 oluşturur (bundan böyle "s-tau" olarak anılacaktır) temel olarak hiperfosforile tau proteinini içerir. Tau nöronal sinyalizasyon ve insan ticareti 9,10 için gerekli olan aksonal taşımacılığının kolaylaştırılması düşünülen bir mikrotübül ilişkili bir proteindir. Her tau molekülü 2 ila 3 normal beyin fosfat, ancak tauopathy hastalarda 11 birkaç kat fosforıl içerik artar içerir. Çoklu kinazlar GSK3 (glikojen sintaz kinaz 3β) ve CDK5 (siklin-de dahil olmak üzere, Tau hiperfosforizasyon'un katkı muhtemeldirasılı kinaz 5) 12,13, ancak patolojik fosforizasyonundan doğrudan tetik zor 14 kalır. Veya mikrotübül bağlanma motifleri yakınındaki anormal fosforilasyon mikrotübül 15 gelen tau ayırır ve p-tau sonunda, NFT inklüzyonlar içine polimerize olabilir, düz veya eşleştirilmiş sarmal filamanlar halinde oligomerizes somatodendritik bölmesi yerine tau yanlış lokalizasyon neden olur. tau hiperfosforilasyon, NFT oluşumu ve nörodejenerasyonda arasındaki yakın bağ p-tau yumaklar apoptotik ve diğer sitotoksik tepkiler, ve böylece tauopathy nörodejenerasyonda 16,17 altında yatan nedeni olduğunu bir yaygın hipotezine yol açtı. Bu öncül dayalı ilaç ekranları ve erken klinik testler 18 başlatılmıştır. Ancak, bu hipotez zorluklarla 19,20 karşıyadır. Örneğin, SantaCruz ve diğ., Transgenik farelerin bilişsel işlevler bir mutant ekspresyonunu bastırmak suretiyle geliştirilebilir gösterdiNFTler mevcut tau molekülleri 21 oluşturmak için devam olsa insan tau. Bir Drosophila modelinde, NFT temel nöron hücreleri 22,23 korumak için toksik sitosolik tau tecrit gösterilmiştir. Açıktır ki, NFT patogenezi rolü, eğer varsa, çok tauopathy terapötik geliştirme yönünde etkileyecektir.
Birkaç β-tabaka tercih edilen floresan boyalar, elektron mikroskobu, ışık saçılması spektroskopisi 24-27 bağlanması ile gösterildiği gibi, yüksek konsantrasyonlarda, yeniden birleştirici ya da normal beyin tau proteini içinde kendiliğinden yavaş yavaş, in vitro olarak, bir PHF-benzeri bir yapı haline polimerize eder. Ekleme heparin ya da arakidonik asit, insan beyninin bir miktarda yağ asidi, büyük ölçüde tau isoform- ve indükleyici, konsantrasyona bağımlı bir davranış 28-32 içinde PHF oluşumunu hızlandırır. Ilginç hiperfosforilize tau AD beyinlerinden saflaştırılmış veya in vitro fosforilasyon reaksiyonlarında ayrıntılı tarafından hazırlananDaha hızlı ve daha verimli bir ggregates 26,33-35. Bu sonuçlar p-tau patolojik rolleri ile mükemmel bir uyum içindedir. F-tau agregasyonu dayanan bir in vitro sistem, böylece, AD ilaç taraması için güçlü bir araç olarak hizmet edebilmektedir.
Tau toplanması ve AD ilerici nörodejenerasyona arasındaki yakın ilişki, yanı sıra Aβ plak hedefleme ilaç geliştirme son yetmezliği, MS 36-38 başka önemli histolojik işaretleyici, tau toplama artıyor kontrol ilaçları keşfetmek ilgi göz önüne alındığında. Nitekim, çeşitli gruplar zaten birincil tahlil gibi in vitro tau toplama reaksiyonlarda kullanarak, farklı verim ilaç ekranları başladı. Bir kimyasal madde sayısı in vitro 39-42 tau agregasyonu üzerinde inhibe edici ya da tersine aktivite sergilediği bulundu. Ancak, mevcut tüm tau toplama regülatörü ekranlar fosfor anahtar patolojik işareti özlüyor değiştirilmemiş tau kullanınylation, AD tedavisinde bu bileşiklerin kullanıldığı özgüllük ve etkinliği için bir endişe yükselterek.
Biyokimyasal karakterizasyonu AD ilaç taraması için çekiş tahlilleri geliştirilmesi önemli engellerden biri patofizyolojik ilgili hiperfosforile tau proteininin yeterli miktarlarda üretilmesidir. Tau 1N4R izoformu ve GSK-3β kinaz E. koeksprime edildiği Fermuarlar Destekli Kataliz sistemi kullanarak E. coli lösin zipper füzyon proteinleri olarak, bu sorunun üstesinden gelebilmek olan (. Sui ve arkadaşları, R.L. tau ve p-tau son ürünler için bakınız Şekil 1, aynı zamanda, p-tau ön kütle spektrometresi karakterizasyonu için 43 bakınız). Tau'nun farklı fosforilasyon bölgeleri için özel dokuz bir antikorlar panelinin kaynaktan, pozitif sinyaller sekiz pozisyonda görülmüştür (veriler gösterilmemiştir). Aşağıda, biz toplama kinetik d ayırt edebilir protokolleri ve instrumentations tarifdeğiştirilmemiş tau ve p-tau türleri arasındaki ifferences. Bu testler amiloid (tau agrega) üzerine Tioflavin T (ThT) veya tioflavin S (THS) olarak floresan artışı 26 bağlayıcı ölçülen yayınlanan protokolleri modifiye edildi. İlk "terminali", hiçbir boya yaklaşımı, toplama reaksiyonları monte edilir ve amiloid boya yokluğunda kuluçkaya. Farklı zaman noktalarında, her bir reaksiyonun bir tümböleni çıkarıldı ve tau toplulukları bağlamak için THT toplanmasını durdurmak ve izin vermek için ThT-içeren tampon eşit hacmi ile karıştırılmıştır. Floresans, bir IAP FluoroMax-2 florometre ile ölçülür. "Ile-boya" İkinci sürekli izleme deneyi, ThT veya THS toplama reaksiyonlarda yer almaktadır. Floresan elle tüm deney boyunca sürekli olarak ölçülür veya çok plaka okuyucu kullanarak olabilir. Buna ek olarak, sürekli ölçüm mo toplama için tau ve p-tau yakın bir fizyolojik konsantrasyon kullanan bir analiz tanımlamaktadırlarde. fosforilasyon etki hali hazırda farkedilebilir şekilde kalır. Aşağıda, biz adım adım operasyon prosedürlerini tanımlamak ve bu tahlillerin temsilcisi sonuçları gösterecektir. Her yaklaşımın artılarını ve eksilerini bazı Tartışma, yanı sıra potansiyel ilaç tarama uygulamaları takip edecek.
Yüksek konsantrasyonda tau kendiliğinden amiloid benzeri yapılar halinde toplanır. Bununla birlikte, laboratuvarda tau fibrillization tipik haliyle bu tür teşvik ediciler olarak heparin (ortalama molekül ağırlığı 6000 g / mol) ve arakidonik asit ile hızlandırılır. Burada gösterilen örnek 30 uM heparin içerir. Tau amiloid birikintilerinin oluşmasının Tioflavin T (ThT) ile ya da S (ths) Thioflavin bağlayıcı amiloid elde edilen fluoresans ile izlenir. (:;: 485 nm tepe emisyon 450 nm eksitasyon) tau topluluklarının bağlanma üzerine, ThT floresans kırmızı kayma gösterir. Ths, diğer taraftan, amiloid bağlayıcı önce 510 nm'de (450 nm'de uyanm) zayıf emisyon vardır, ancak bu fluorescencBu tür birleştirilmiş tau 44 gibi önemli bir amiloid proteininin mevcudiyetinde E artar. Her iki boya da tau ve p-tau bağlantısını tespit iyi çalışır. Çünkü ThT (bakınız Şekil 2), güçlü ve nispeten geniş emisyon tepe, 510 nm'de flüoresan biriminde sadece% 30 bir azalma vardır. Ya boya kullanırken kolaylık sağlamak için, biz tau izlemek için uyarma / emisyon dalga boylarında (yani, 450 nm / 510 nm) aynı kombinasyonunu kullanabilirsiniz.
Tau agregasyonu deneyinin amacına ve tau proteininin mevcudiyetine bağlı olarak, boya varlığında veya yokluğunda yapılabilir. Reaksiyonların her ikisi de modları aşağıda gösterilmiştir. Tek-örneklem flüorometre (ISA-Spex FluoroMax-2) ve bir çok plaka okuyucu (SpectraMax M2) – Ayrıca, iki farklı araçların çalışmasını göstermektedir. Okuyucular kendi özel ihtiyaçlarını ve enstrüman kullanılabilirliğini uygun bu protokolleri adapte gerekir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, farklı tahlil koşulları ve fosforilasyon-bağımlı hızlı tau toplama kinetik tespit aletleri gösterir. Terminal deneyde, floresans boya ThT her zaman noktasında ana karışımı çıkarılır reaksiyonun bir kısmına ilave edilir. Amiloid floresan sonra 26 ölçülür kaynaklı bağlanma. İkinci olarak, birlikte-boya modunda, tau agregasyonu tau topluluklarının büyüme gerçek-zamanda değerlendirilmesi için uygun bir reaksiyon, bu tür işleme, ThT veya ths mevcudiyetinde gerçekle…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the National Institute on Aging (AG039768) to MHK. We thank Drs. Thomas Sharkey and Honggao Yan for generously providing the instruments, as well Sean Weise and Yan Wu for technical assistance.
Materials
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments |
| Trizma base | Sigma | T1503 | |
| NaCl | Macron Fine Chemicals | MAL-7581-06 | |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Invitrogen | 15576-028 | |
| Thioflavin T | Sigma | T3516 | Stored in dark |
| Thioflavin S | Sigma | T1892 | Stored in dark |
| heparin | Sigma | H3393 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D9779 | Stored at 4°C |
| 96-well plate | Corning | 3917 | |
| ISA SPEX FluoroMax-2 | Horiba | ||
| SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader | Molecular Devices | ||
| Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody | R&D Systems | MAB3494 | Stored at –80° |
References
- Lee, V. M., Goedert, M., Trojanowski, J. Q. Neurodegenerative tauopathies. Annu Rev Neurosci. 24, 1121-1159 (2001).
- Ballatore, C., Lee, V. M., Trojanowski, J. Q. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer’s disease and related disorders. Nat Rev Neurosci. 8 (9), 663-672 (2007).
- Arriagada, P. V., Marzloff, K., Hyman, B. T. Distribution of Alzheimer-type pathologic changes in nondemented elderly individuals matches the pattern in Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (9), 1681-1688 (1992).
- Arriagada, P. V., Growdon, J. H., Hedley-Whyte, E. T., Hyman, B. T. Neurofibrillary tangles but not senile plaques parallel duration and severity of Alzheimer’s disease. Neurology. 42 (3 Pt 1), 631-639 (1992).
- Bancher, C., Braak, H., Fischer, P., Jellinger, K. A. Neuropathological staging of Alzheimer lesions and intellectual status in Alzheimer’s and Parkinson’s disease patients. Neurosci Lett. 162 (1-2), 179-182 (1993).
- Guillozet, A. L., Weintraub, S., Mash, D. C., Mesulam, M. M. Neurofibrillary tangles, amyloid, and memory in aging and mild cognitive impairment. Arch Neurol. 60 (5), 729-736 (2003).
- Hasegawa, M., et al. Protein sequence and mass spectrometric analyses of tau in the Alzheimer’s disease brain. J Biol Chem. 267 (24), 17047-17054 (1992).
- Matsuo, E. S., et al. Biopsy-derived adult human brain tau is phosphorylated at many of the same sites as Alzheimer’s disease paired helical filament tau. Neuron. 13 (4), 989-1002 (1994).
- Bamburg, J. R., Bloom, G. S. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease. Cell Motil Cytoskeleton. 66 (8), 635-649 (2009).
- Denk, F., Wade-Martins, R. Knock-out and transgenic mouse models of tauopathies. Neurobiol Aging. 30 (1), 1-13 (2009).
- Gong, C. X., Iqbal, K. Hyperphosphorylation of microtubule-associated protein tau: a promising therapeutic target for Alzheimer disease. Curr Med Chem. 15 (23), 2321-2328 (2008).
- Mazanetz, M. P., Fischer, P. M. Untangling tau hyperphosphorylation in drug design for neurodegenerative diseases. Nat Rev Drug Discov. 6 (6), 464-479 (2007).
- Brunden, K. R., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. Advances in tau-focused drug discovery for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Nat Rev Drug Discov. 8 (10), 783-793 (2009).
- Querfurth, H. W., LaFerla, F. M. Alzheimer’s disease. N Engl J Med. 362 (4), 329-344 (2010).
- Buee, L., Bussiere, T., Buee-Scherrer, V., Delacourte, A., Hof, P. R. Tau protein isoforms, phosphorylation and role in neurodegenerative disorders. Brain Res Brain Res Rev. 33 (1), 95-130 (2000).
- Lee, V. M., Brunden, K. R., Hutton, M., Trojanowski, J. Q. Developing therapeutic approaches to tau, selected kinases, and related neuronal protein targets. Cold Spring Harb Perspect Med. 1 (1), 006437 (2011).
- Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Biochemistry and cell biology of tau protein in neurofibrillary degeneration. Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (7), a006247 (2012).
- Bulic, B., Pickhardt, M., Mandelkow, E. Progress and Developments in Tau Aggregation Inhibitors for Alzheimer Disease. J Med Chem. 56 (11), 4135-4155 (2013).
- Cowan, C. M., Quraishe, S., Mudher, A. What is the pathological significance of tau oligomers. Biochem Soc Trans. 40 (4), 693-697 (2012).
- Spires-Jones, T. L., Kopeikina, K. J., Koffie, R. M., de Calignon, A., Hyman, B. T. Are tangles as toxic as they look. J Mol Neurosci. 45 (3), 438-444 (2011).
- SantaCruz, K., et al. Tau suppression in a neurodegenerative mouse model improves memory function. Science. 309 (5733), 476-481 (2005).
- Wittmann, C. W., et al. Tauopathy in Drosophila: neurodegeneration without neurofibrillary tangles. Science. 293 (5530), 711-714 (2001).
- Shulman, J. M., Feany, M. B. Genetic modifiers of tauopathy in Drosophila. Génétique. 165 (3), 1233-1242 (2003).
- Wille, H., Drewes, G., Biernat, J., Mandelkow, E. M., Mandelkow, E. Alzheimer-like paired helical filaments and antiparallel dimers formed from microtubule-associated protein tau in vitro. J Cell Biol. 118 (3), 573-584 (1992).
- Alonso, A., Zaidi, T., Novak, M., Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K. Hyperphosphorylation induces self-assembly of tau into tangles of paired helical filaments/straight filaments. Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (12), 6923-6928 (2001).
- Barghorn, S., Biernat, J., Mandelkow, E. Purification of recombinant tau protein and preparation of Alzheimer-paired helical filaments in vitro. Methods Mol Biol. 299, 35-51 (2005).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Polymerization of microtubule-associated protein tau under near-physiological conditions. J Biol Chem. 270 (41), 24306-24314 (1995).
- Wilson, D. M., Binder, L. I. Free fatty acids stimulate the polymerization of tau and amyloid beta peptides. In vitro evidence for a common effector of pathogenesis in Alzheimer’s disease. Am J Pathol. 150 (6), 2181-2195 (1997).
- Perez, M., Valpuesta, J. M., Medina, M., Montejo de Garcini, E., Avila, J. Polymerization of tau into filaments in the presence of heparin: the minimal sequence required for tau-tau interaction. J Neurochem. 67 (3), 1183-1190 (1996).
- Carlson, S. W., et al. A complex mechanism for inducer mediated tau polymerization. Biochimie. 46 (30), 8838-8849 (2007).
- Goedert, M., et al. Assembly of microtubule-associated protein tau into Alzheimer-like filaments induced by sulphated glycosaminoglycans. Nature. 383 (6600), 550-553 (1996).
- King, M. E., Gamblin, T. C., Kuret, J., Binder, L. I. Differential assembly of human tau isoforms in the presence of arachidonic acid. J Neurochem. 74 (4), 1749-1757 (2000).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pseudo-phosphorylation of tau at Ser202 and Thr205 affects tau filament formation. Brain Res Mol Brain Res. 138 (1), 84-93 (2005).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Pre-assembled tau filaments phosphorylated by GSK-3b form large tangle-like structures. Neurobiol Dis. 31 (3), 368-377 (2008).
- Grundke-Iqbal, I., et al. Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau (tau) in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc Natl Acad Sci U S A. 83 (13), 4913-4917 (1986).
- Castellani, R. J., Perry, G. Pathogenesis and disease-modifying therapy in Alzheimer’s disease: the flat line of progress. Arch Med Res. 43 (8), 694-698 (2012).
- Green, R. C., et al. Effect of tarenflurbil on cognitive decline and activities of daily living in patients with mild Alzheimer disease: a randomized controlled trial. JAMA. 302 (23), 2557-2564 (2009).
- Gauthier, S., et al. Effect of tramiprosate in patients with mild-to-moderate Alzheimer’s disease: exploratory analyses of the MRI sub-group of the Alphase study. J Nutr Health Aging. 13 (6), 550-557 (2009).
- Pickhardt, M., et al. Anthraquinones inhibit tau aggregation and dissolve Alzheimer’s paired helical filaments in vitro and in cells. J Biol Chem. 280 (5), 3628-3635 (2005).
- Crowe, A., Ballatore, C., Hyde, E., Trojanowski, J. Q., Lee, V. M. High throughput screening for small molecule inhibitors of heparin-induced tau fibril formation. Biochem Biophys Res Commun. 358 (1), 1-6 (2007).
- Taniguchi, S., et al. Inhibition of heparin-induced tau filament formation by phenothiazines, polyphenols, and porphyrins. J Biol Chem. 280 (9), 7614-7623 (2005).
- Sigurdsson, E. M. Tau-focused immunotherapy for Alzheimer’s disease and related tauopathies. Curr Alzheimer Res. 6 (5), 446-450 (2009).
- Tan, Y. J., et al. Phosphopeptide Enrichment with TiO-Modified Membranes and Investigation of Tau Protein Phosphorylation. Anal Chem. 85 (12), 5699-5706 (2013).
- Santa-Maria, I., Perez, M., Hernandez, F., Avila, J., Moreno, F. J. Characteristics of the binding of thioflavin S to tau paired helical filaments. J Alzheimers Dis. 9 (3), 279-285 (2006).
- Lira-De Leon, K. I., et al. Molecular mechanism of tau aggregation induced by anionic and cationic dyes. J Alzheimers Dis. 35 (2), 319-334 (2013).
- DiNitto, J. P., Wang, L., Wu, J. C. Continuous fluorescence-based method for assessing dicer cleavage efficiency reveals 3′ overhang nucleotide preference. BioTechniques. 48, 303-311 (2010).
- Maeda, S., et al. Granular tau oligomers as intermediates of tau filaments. Biochimie. 46 (12), 3856-3861 (2007).
- Pickhardt, M., et al. Phenylthiazolyl-hydrazide and its derivatives are potent inhibitors of tau aggregation and toxicity in vitro and in cells. Biochimie. 46 (35), 10016-10023 (2007).
- Rankin, C. A., Sun, Q., Gamblin, T. C. Tau phosphorylation by GSK-3beta promotes tangle-like filament morphology. Mol Neurodegener. 2, 12 (2007).
- McKee, A. C., et al. Chronic traumatic encephalopathy in athletes: progressive tauopathy after repetitive head injury. J Neuropathol Exp Neurol. 68 (7), 709-735 (2009).
- Herrup, K. Reimagining Alzheimer’s disease–an age-based hypothesis. J Neurosci. 30 (50), 16755-16762 (2010).
- Gavett, B. E., Stern, R. A., McKee, A. C. Chronic traumatic encephalopathy: a potential late effect of sport-related concussive and subconcussive head trauma. Clin Sports Med. 30 (1), 179-188 (2011).
- Tsitsopoulos, P. P., Marklund, N. Amyloid-beta Peptides and Tau Protein as Biomarkers in Cerebrospinal and Interstitial Fluid Following Traumatic Brain Injury: A Review of Experimental and Clinical Studies. Front Neurol. 4, 79 (2013).
