In vitro aggregatietesten gebruiken hypergefosforyleerd Tau proteïne

Summary

Ongemodificeerde en hypergefosforyleerd tau-eiwitten werden twee in vitro aggregatie-assays om de hyperfosforylering afhankelijke snelle aggregatie kinetiek onthullen. Deze assays weg effenen voor toekomstige schermen voor verbindingen die de neiging van hypergefosforyleerde tau kan moduleren fibrillen die de progressie van de ziekte van Alzheimer ten grondslag vormen.

Abstract

Alzheimer’s disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer’s disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

Introduction

De ziekte van Alzheimer (AD) is één van een grote collectie van neurodegeneratieve aandoeningen bekend als tauopathieen. De typische pathologie onderliggende tauopathie is de tangles, NFTs, in neuronen, astrocyten en microglia ^1-4. De NFT dichtheid correleert met cognitieve stoornissen ^3,5 en neuron verlies ^6. NFT bevat voornamelijk hypergefosforyleerde tau-eiwit (aangeduid als "p-tau" voortaan) die recht of gepaarde helixvormige filamenten (PHF) ^7,8 vormt. Tau is een microtubuli geassocieerde eiwit dacht bij axonale transport, dat is onontbeerlijk voor de neuronale signalering van en handel ^9,10 vergemakkelijken. Elke tau molecuul 2-3 fosfaten in normale hersenen, maar de fosforylgroep gehalte toeneemt door verscheidene vouwen in tauopathie patiënten ^11. Meerdere kinases zijn waarschijnlijk bijdragen tot tau hyperfosforylatie inclusief GSK3P (glycogeensynthasekinase 3β) en CDK5 (cycline-dekelijke kinase 5) ^12,13, maar de directe aanleiding voor de pathologische fosforylering blijft ongrijpbaar ^14. Abnormale fosforylatie in of nabij de microtubuli bindende motieven dissocieert tau de microtubule ^15, en veroorzaakt tau mis-lokalisatie aan het somatodendritische compartiment waar p-tau oligomerizes in rechte of gepaarde spiraalvormige filamenten die uiteindelijk kunnen polymeriseren in NFT insluitsels. De nauwe band tussen tau hyperfosforylatie, NFT vorming, en neurodegeneratie leidde tot een heersende hypothese dat p-tau klitten ontlokken apoptotische en andere cytotoxische reacties, en daarmee is de onderliggende oorzaak voor tauopathie neurodegeneratie ^16,17. Drug schermen en vroege klinische tests op basis van dit uitgangspunt zijn gelanceerd ^18. Echter, deze hypothese wordt geconfronteerd met uitdagingen ^19,20. Bijvoorbeeld SantaCruz et al. Toonden aan dat cognitieve functies van transgene muizen kunnen worden verbeterd door het onderdrukken van de expressie van een mutantmenselijke tau, hoewel NFT blijven vormen bestaande tau moleculen ^21. In een Drosophila model, werd aangetoond dat de NFT toxische cytosolische tau sekwestreren de onderliggende zenuwcellen ^22,23 beschermen. Duidelijk de pathogenese rol van NFT eventuele sterk zal beïnvloeden richting tauopathie therapeutische ontwikkeling.

In hoge concentraties recombinant of normale hersenen tau-eiwit spontaan maar langzaam polymeriseert in een PHF-achtige structuur in vitro, zoals aangegeven door de binding van verschillende β-sheet voorkeur fluorescente kleurstoffen, elektronenmicroscopie en lichtverstrooiing spectroscopie ^24-27. Het toevoegen van heparine of arachidonzuur, een overvloedige vetzuur in menselijke hersenen, drastisch versnelt PHF formatie tau isoform- en inductor concentratieafhankelijke manieren ^28-32. Intrigerend hypergefosforyleerde tau gezuiverd van AD hersenen of door uitputtend in vitro bereid fosforyleringsreacties eenggregates sneller en efficiënter ^26,33-35. Deze resultaten zijn in uitstekende overeenkomst met de pathologische rol van p-tau. Een in vitro systeem gebaseerd op de aggregatie van p-tau kan dus dienen als een krachtig hulpmiddel voor AD drug screening.

Gezien de nauwe samenwerking tussen tau-aggregatie en de progressieve neurodegeneratie van AD, evenals de recente mislukking in de ontwikkeling van geneesmiddelen gericht op de AP-plaque, een andere belangrijke histologische marker van AD ^36-38, de belangstelling voor het ontdekken van geneesmiddelen die controle tau aggregatie stijgt. Inderdaad hebben verscheidene groepen al begonnen drug schermen op verschillende verwerkingscapaciteit hand van in vitro tau aggregatie reacties als primaire assay. Een aantal chemische stoffen bleken remmende of omkering activiteiten op tau aggregatie vertonen in vitro ^39-42. Echter, alle huidige tau aggregatie regulator schermen gebruiken ongewijzigde tau dat de belangrijkste pathologische kenmerk van fosfor mistylering, verhogen een zorg voor de specificiteit en de werkzaamheid van deze verbindingen bij AD behandeling.

Een van de belangrijkste hindernissen ontwikkelen aggregatie assays voor biochemische karakterisering en AD drug screening is de productie van voldoende hoeveelheden van het pathofysiologisch relevante hypergefosforyleerd tau-eiwit. Met behulp van de ritsen geassisteerde katalyse systeem waarin de 1N4R isoform van tau en de GSK-3β kinase gelijktijdig worden gebracht in E. coli leucine zipper fusie-eiwitten hebben we deze uitdaging overwinnen (. Sui et al, ingediend; zie Figuur 1 voor de eindproducten van tau en p-tau, zie ook ⁴³ een voorlopige massaspectrometrie karakterisering van p-tau). Uit een panel van negen antilichamen specifiek voor verschillende fosforylatieplaatsen van tau werden positieve signalen waargenomen in acht posities (gegevens niet getoond). Hieronder beschrijven we protocollen en instrumentaties die kunnen onderscheiden van de aggregatie kinetische differences tussen ongewijzigde tau en p-tau soorten. Deze testen werden gewijzigd ten opzichte van gepubliceerde protocollen dat de toename van de fluorescentie van thioflavine T (ThT) of thioflavin S (THS) op amyloid (tau aggregaten) binding ²⁶ gemeten. In de eerste "terminal", geen kleurstof benadering aggregatie reacties worden samengevoegd en geïncubeerd in de afwezigheid van de amyloïde kleurstof. Op verschillende tijdstippen is een monster van elke reactie verwijderd en gemengd met een gelijk volume van de ThT bevattende buffer aggregatie stoppen en laat ThT tau aggregaten binden. Fluorescentie wordt gemeten door een IAP FluoroMax-2 fluorometer. In de tweede "met kleurstof" continue bewaking test ThT of THS is bij de aggregatie reacties. Fluorescentie kan manueel continu gemeten gedurende het gehele experiment of een multi-plaatlezer. Verder beschrijven we een test die een bijna fysiologische concentratie van tau en p-tau gebruikt voor aggregatie in de continue meting mode. Het effect van fosforylering steeds gemakkelijk detecteerbaar. Hieronder wordt stap voor stap bedieningsprocedures beschrijven en tonen representatieve resultaten van deze assays. Bespreking van een aantal van de voor-en nadelen van elke benadering, evenals de mogelijke drug discovery programma's zullen volgen.

Bij een hoge concentratie, tau aggregaten in amyloïd-achtige structuren spontaan. In het laboratorium, tau fibrillization wordt gewoonlijk versneld door inductoren zoals heparine (gemiddeld molecuulgewicht 6000 g / mol) en arachidonzuur. Voorbeelden hierin zijn inclusief 30 uM heparine. De vorming van tau amyloïde aggregaten wordt door de fluorescentie verkregen uit amyloïde binden door thioflavine T (ThT) of Thioflavin S (THS). Na binding aan tau aggregaten, ThT vertoont een rode verschuiving in fluorescentie (excitatie: 450 nm; piekemissie: 485 nm). THS, daarentegen, heeft zwakke emissie bij 510 nm (excitatie bij 450 nm) voordat amyloïde binden, maar dit fluorescence significant in aanwezigheid van amyloïde eiwit toeneemt als de geaggregeerde tau ^44. Beide kleurstoffen werken goed in het opsporen van tau en p-tau-aggregatie. Vanwege de sterke en relatief brede emissiepiek van ThT (zie figuur 2), is er slechts 30% verlaging van de fluorescentie-eenheid bij 510 nm. Gemakshalve gebruiken we dezelfde combinatie van excitatie / emissie golflengten (bijvoorbeeld 450 nm / 510 nm) tau aggregatie controleren wanneer met behulp van kleurstof.

Tau aggregatie kan in aanwezigheid of afwezigheid van de kleurstof, afhankelijk van het doel van de test en de beschikbaarheid van tau-eiwit. Beide modi van reacties worden hieronder weergegeven. Verder tonen we de werking van twee verschillende instrumenten – één monster fluorometer (ISA-SPEX FluoroMax-2) en een multi-plate reader (SpectraMax M2). Lezers moeten in staat zijn om deze protocollen aan te passen aan hun specifieke behoeften en beschikbaarheid instrument aan te passen.

Protocol

1. Bereiding van reagentia Bereid aggregatie buffer (20 mM Tris, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA). Bewaar bij RT, stabiel maanden. Supplement 1 mM dithiothreitol (DTT) vóór gebruik. OPMERKING: een HEPES-gebaseerde buffer (10 mM HEPES, pH 7,5, 0,1 mM EDTA, 5 mM DTT) produceert dezelfde resultaten tau aggregatie. Bereid thioflavin T of thioflavin S stockoplossing (3 mM, opgelost in aggregatie buffer) en filter door 0,22 pm steriele filter unit. Bewaren bij -20 ° C in een buis onder aluminiumf…

Representative Results

Met behulp van recombinant tau en p-tau (Figuur 1), hebben we twee verschillende protocollen om de kinetiek van aggregatie van tau en p-tau vergelijken, profiteren van de sterke fluorescentie emissie van ThT en THS na binding aan proteïneaggregaten amyloidal, waaronder tau en p-tau (Figuur 2). Met of zonder de fluorescente kleurstof in de aggregatie reactie zagen we consistente verhoging van tau aggregatie door hyperfosforylering (figuren 3-5). Deze stimulatie is onafh…

Discussion

Dit protocol toont verschillende testomstandigheden en instrumenten die de fosforylering-afhankelijke snel tau aggregatie kinetiek detecteren. In de terminal assay, wordt de fluorescentie kleurstof ThT toegevoegd aan een deel van het reactiemengsel uit de master mix op elk tijdstip. Amyloid binding geïnduceerde fluorescentie wordt vervolgens gemeten ^26. In de tweede, met kleurstof modus tau aggregatie in aanwezigheid van ThT of THS uitgevoerd, zodat dit type reactie geschikt voor real-time automatische beoor…

Materials

Name of the reagent	Company	Catalogue number	Comments
Trizma base	Sigma	T1503
NaCl	Macron Fine Chemicals	MAL-7581-06
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Invitrogen	15576-028
Thioflavin T	Sigma	T3516	Stored in dark
Thioflavin S	Sigma	T1892	Stored in dark
heparin	Sigma	H3393
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D9779	Stored at 4°C
96-well plate	Corning	3917
ISA SPEX FluoroMax-2	Horiba
SpectraMax M2 Multi-Mode Microlate Reader	Molecular Devices
Mouse Anti-Tau Monoclonal Antibody	R&D Systems	MAB3494	Stored at –80°