Analyse af epitelbeskadigelse Produceret af<em> Entamoeba histolytica</em> Infektion
Summary
Human infektion med Entamoeba histolytica fører til amoebiasis, en væsentlig årsag til diarré i tropiske lande. Infektion initieres af patogen interaktioner med tarmepitelceller, provokerer åbningen af celle-celle-kontakter, og dermed diarré, undertiden efterfulgt af lever-infektion. Denne artikel indeholder en model til at vurdere de tidlige vært-patogen interaktioner at forbedre vores forståelse af amoebiasis patogenese.
Abstract
Entamoeba histolytica er det agens af human amoebiasis, en væsentlig årsag til diarré og hepatisk absces i tropiske lande. Infektion initieres ved interaktion af patogenet med intestinale epitelceller. Denne interaktion fører til forstyrrelse af intercellulære strukturer såsom stramme vejkryds (TJ). TJ sikre forsegling af epithellaget at adskille værtsvæv fra tarmlumen. Nylige undersøgelser viser, at forstyrrelse af TJ af den parasitiske protein EhCPADH112 er en forudsætning for E. histolytica invasion, der er ledsaget af epitelbarriere dysfunktion. En analyse af molekylære mekanismer involveret i TJ demontering under E. histolytica invasion er af afgørende betydning for at forbedre vores forståelse af amoebiasis patogenese. Denne artikel præsenterer en nem model, der tillader en vurdering af de første host-patogen interaktioner og parasitten invasion potentiale. Parametre, der skal analyseres omfatter transepithelial elektrisk modstand, interaktion af EhCPADH112 med epiteloverflade receptorer, ændringer i udtryk og lokalisering af epitelial forbindelsemotiver markører og lokalisering af parasit-molekyler inden epitelceller.
Introduction
Entamoeba histolytica er en enkelt celle protozo ansvarlige human amoebiasis en tarminfektion forårsager betændelse og diarré. E. histolytica inficerer op til 50 millioner mennesker årligt, men kun omkring 10% af de smittede mennesker udvikler symptomer forbundet til amoebiasis 1. Smitte sker ved indtagelse af forurenet mad eller vand, som indeholder E. histolytica cyster. I tarmen, cyster producerer levende trofozoitter der overholder kolon mucin og formere 2. Trofozoitter sædvanligvis cyster, der udskilles via afføring. I andre tilfælde og endnu ukendte grunde trophozoitter bryde den intestinale epitel lag og invadere underliggende væv. I værste tilfælde, de træder ind i blodet og påvirke andre organer såsom lever 3..
Breaking epitelbarrieren kræver afbrydelse af epitelial transmembrale strukturer, der opretholder cellerne samles. Epitelcellekontakter dannes ved apikale forbindelsesmangfoldighed kompleks bestående af fast (TJ) og adherens junctions (AJ) og desmosomes 4. De mest apikale junctions er TJ, og derfor er de første barriere fornærmet af E. histolytica og nogle andre patogener under host invasion. TJ består af transmembrale adhæsionsreceptorer såsom claudins, occludin og Junctional adhæsionsmolekyler (JAM), der deltager i homo-eller heterofile interaktioner med receptorer på det tilstødende celle. De er intracellulært bundet af stillads molekyler af de zonula occludens (ZO) familie, der forbinder adhæsionsreceptorer til aktincytoskelet at give yderligere mekanisk styrke til epitel. TJ er ansvarlige for forsegling tarmvæv fra tarmlumen, forhindrer overdreven vand og opløste lækage. Således, efter TJ er forstyrret af parasitten, er væv invaderet. E. histolytica udskiller flere molekyler såsom: (i) der er involveret i vedhæftning af amøber til TargET celler 5; (Ii) faktorer membranaktive deltager i drab af værtsceller ved exocytose, for eksempel ionkanal-dannende peptider betegnes amoebapores 6,7; og (iii) proteinaser, som nedbryder ekstracellulære matrixproteiner og medierer væv disintegration 5,8,9.
Den cysteinprotease EhCP112 og adhesionsmolekylet EhADH112 der tilsammen danner EhCPADH112 komplekset er to E. histolytica virulens proteiner, der spiller en stor rolle i demonteringen af TJ 10. Levende trophozoitter, deres samlede lysater og udskilte produkter fremkalde molekylære ændringer i TJ komplekse og funktionelle forstyrrelser af epitelbarriere. I denne undersøgelse er det vist, at EhCP112 og EhADH112 interagere med occludin og claudin-1-proteiner, der fører til internalisering og nedbrydning af celle proteiner, hvilket vil lette E. histolytica indgang gennem paracellulære vej.
Vores data og dem, of andre grupper 11-17 tyder stærkt på nødvendigheden af specifikke vært-patogen interaktioner, der tillader parasit invasion. Unraveling det molekylære grundlag af disse interaktioner er af allerstørste betydning for en bedre forståelse af amoebiasis patogenese. Selektiv forstyrrelse af TJ af trophozoitter, kendetegnet ved forøget paracellulær permeabilitet, kan måles ved et fald i transepithelial elektrisk modstand (TER). Overføringen af parasitiske proteiner hen imod værten epitel kan bestemmes ved hjælp af immunfluorescens-farvning og konfokal lasermikroskopi, en metode, kan også afsløre co-lokalisering af amøber virulensfaktorer med epiteliale synaptiske markører angiver mulige direkte vekselvirkninger. I denne artikel beskriver vi i detaljer, hvordan epitelceller og trophozoitter dyrkes, høstes og manipuleret til at undersøge host-patogen interaktioner og deres konsekvenser.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at studere in vitro host-patogen interaktioner i løbet af epitelial infektion med E. histolytica, er det afgørende at arbejde med veletablerede kulturer af både epitelceller og trofozoitter. For eksempel, tidligere E. histolytica kulturer var normalt blevet etableret i forbindelse med visse arter af bakterier eller trypanosomatids 22,23. Men co-dyrkning af E. histolytica kulturer er kontraproduktivt for studiet af host-patogen interaktioner, fordi observerede virknin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).
Materials
| Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A | IMSS Hospital, Mexico | Without/number | Virulent trophozoites18 |
| TYI broth | Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich |
211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879 |
3.45% BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6.5 mM K2HPO4 16.3 mM ascorbic acid 8.1 mM L-cysteine 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819 |
| Bovine serum adult | Microlab , Labs., Mex. | SU146 | Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min |
| Diamond vitamin mixture- Tween 80 | In vitro | SR-07 | Use at 3% |
| Penicillin | Lakeside, Méx. | 34564SSA IV | 0.5 IU/mL |
| Streptomycin | Lakeside, Méx. | 75757SSA IV | 35 µg/ mL |
| Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps | Corning-Pyrex | 9826-16X | 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature |
| Cell culture plates, 6 Well | Corning-Costar | 3516 | Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2. Rings on lid prevent cross-contamination |
| 25cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430168 | Canted neck flasks |
| MDCK (Madin Darby canine kidney) type I | American Type Culture Collection | CCL34 | Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage |
| DMEM medium | Gibco | 12800-017 | Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose. |
| Neonate Calf Serum | In vitro | S-02 | Use at 10%. |
| Penicillin/Streptomycin mixture | In vitro | A-01 | Stock solution 10,000 U/µg/mL |
| Insulin | AMSA | 398MJ94SSA IV | Stock solution 100 IU/mL |
| Trypsin solution | In vitro | EN-005 | 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium |
| 75cm2 cell culture flask | Corning-Costar | 430720 | Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium |
| Transwell permeable supports | Corning-Costar | 3470 | 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2 |
| 24 well cell culture dish | Corning-Costar | 3524 | Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic |
| Complete Mini | Roche | 11836 153 001 | Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM |
| Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) | SIGMA-Aldrich | E3132 | Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL |
| pαZO-1 | Invitrogen | 402200 | IgG rabbit policlonal antibody against a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein |
| mαEhCPADH112 | Homemade antibody | Without/ Number | IgM mouse monoclonal antibody against 444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27 |
| FITC-goat anti-mouse IgM | Zymed | 62-6811 | Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary antibody |
| TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) | Zymed | 816114 | Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled goat anti-rabbit IgG secondary antibody. |
| STX2 Electrode | World Precision Instrument | 102711 | Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM |
| EVOM epithelial voltohmmeter | World Precision Instrument | 12111 | Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements |
| Neubauer chamber | MEARIENFELD | 610610 | Hemocytometer |
| Leica TCS_SP5_MO | Leica | Without/number | Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software |
| Vectashield | Vector Laboratories, Inc. | H-1000 | Mounting medium for fluorescence |
| 4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) | SIGMA | D-9542 | 0.05 mM final concentration |
| Bovine serum albumin (BSA) | US Biological | A-1310 | 0.5% final concentration for blocking solution |
References
- Faust, D. M., Guillen, N. Virulence and virulence factors in Entamoeba histolytica, the agent of human amoebiasis. Microbes Infect. 14, 1428-1441 (2012).
- Stauffer, W., Ravdin, J. I. Entamoeba histolytica: an update. Curr Opin Infect Dis. 16, 479-485 (2003).
- Santi-Rocca, J., Rigothier, M. C., Guillen, N. Host-microbe interactions and defense mechanisms in the development of amoebic liver abscesses. Clin Microbiol Rev. 22, 65-75 (2009).
- Turner, J. R. Intestinal mucosal barrier function in health and disease. Nat Rev Immunol. 9, 799-809 (2009).
- Garcia-Rivera, G., et al. Entamoeba histolytica : a novel cysteine protease and an adhesin form the 112 kDa surface protein. Mol Microbiol. 33, 556-568 (1999).
- Leippe, M. Amoebapores. Parasitol Today. 13, 178-183 (1997).
- Leippe, M., Bruhn, H., Hecht, O., Grotzinger, J. Ancient weapons: the three-dimensional structure of amoebapore. A. Trends Parasitol. 21, 5-7 (2005).
- Ocadiz, R., et al. EhCP112 is an Entamoeba histolytica secreted cysteine protease that may be involved in the parasite-virulence. Cell Microbiol. 7, 221-232 (2005).
- Sajid, M., McKerrow, J. H. Cysteine proteases of parasitic organisms. Mol Biochem Parasitol. 120, 1-21 (2002).
- Betanzos, A., et al. The EhCPADH112 complex of Entamoeba histolytica interacts with tight junction proteins occludin and claudin-1 to produce epithelial damage. PLoS One. 8, (2013).
- Lauwaet, T., et al. Proteinase inhibitors TPCK and TLCK prevent Entamoeba histolytica induced disturbance of tight junctions and microvilli in enteric cell layers in vitro. Int J Parasitol. 34, 785-794 (2004).
- Leroy, A., et al. Contact-dependent transfer of the galactose-specific lectin of Entamoeba histolytica to the lateral surface of enterocytes in culture. Infect Immun. 63, 4253-4260 (1995).
- Leroy, A., Lauwaet, T., De Bruyne, G., Cornelissen, M., Mareel, M. Entamoeba histolytica disturbs the tight junction complex in human enteric T84 cell layers. FASEB J. 14, 1139-1146 (2000).
- Leroy, A., et al. Disturbance of tight junctions by Entamoeba histolytica: resistant vertebrate cell types and incompetent trophozoites. Arch Med Res. 31, (2000).
- Lauwaet, T., et al. Entamoeba histolytica trophozoites transfer lipophosphopeptidoglycans to enteric cell layers. Int J Parasitol. 34, 549-556 (2004).
- Kissoon-Singh, V., Moreau, F., Trusevych, E., Chadee, K. Entamoeba histolytica Exacerbates Epithelial Tight Junction Permeability and Proinflammatory Responses in Muc2(-/-) Mice. Am J Pathol. 182, 852-865 (2013).
- Lejeune, M., Moreau, F., Chadee, K. Prostaglandin E2 produced by Entamoeba histolytica signals via EP4 receptor and alters claudin-4 to increase ion permeability of tight junctions. Am J Pathol. 179, 807-818 (2011).
- Orozco, M. E., Martinez Palomo, A., Gonzalez Robles, A., Guarneros, G., Galindo, J. M. Interactions between lectin and receptor mediate the adhesion of E. histolytica to epithelial cells. Relation of adhesion to the virulence of the strains. Arch Invest Med (Mex). 13 Suppl 3, 159-167 (1982).
- Diamond, L. S., Harlow, D. R., Cunnick, C. C. A new medium for the axenic cultivation of Entamoeba histolytica and other Entamoeba. Trans R Soc Trop Med Hyg. 72, 431-432 (1978).
- Strober, W. Trypan blue exclusion test of cell viability. Curr Protoc Immunol. Appendix 3, (2001).
- Arroyo, R., Orozco, E. Localization and identification of an Entamoeba histolytica adhesin. Mol Biochem Parasitol. 23, 151-158 (1987).
- Diamond, L. S. Axenic cultivation of Entamoeba hitolytica. Science. 134, 336-337 (1961).
- Diamond, L. S. Techniques of axenic cultivation of Entamoeba histolytica Schaudinn, 1903 and E. histolytica-like amebae. J Parasitol. 54, 1047-1056 (1968).
- Dukes, J. D., Whitley, P., Chalmers, A. D. The MDCK variety pack: choosing the right strain. BMC Cell Biol. 12, (2011).
- Espinosa-Cantellano, M., Martinez-Palomo, A. Pathogenesis of intestinal amebiasis: from molecules to disease. Clin Microbiol Rev. 13, 318-331 (2000).
- Martinez-Palomo, A., et al. Structural bases of the cytolytic mechanisms of Entamoeba histolytica. J Protozool. 32, 166-175 (1985).
- Martinez-Lopez, C., et al. The EhADH112 recombinant polypeptide inhibits cell destruction and liver abscess formation by Entamoeba histolytica trophozoites. Cell Microbiol. 6, 367-376 (2004).
- Ocadiz-Ruiz, R., et al. Effect of the silencing of the Ehcp112 gene on the in vitro virulence of Entamoeba histolytica. Parasit Vectors. 6, 248 (2013).
- Johnson, L. G. Applications of imaging techniques to studies of epithelial tight junctions. Adv Drug Deliv Rev. 57, 111-121 (2005).
