Summary

Análise do dano epitelial Produzido pela<em> Entamoeba histolytica</em> Infecção

Published: June 12, 2014
doi:

Summary

A infecção humana por Entamoeba histolytica leva a amebíase, uma das principais causas de diarréia em países tropicais. A infecção é iniciada pelo agente patogénico com as células epiteliais do intestino, provocando a abertura dos contactos célula-célula e, consequentemente, a diarreia, por vezes, seguido por uma infecção do fígado. Este artigo fornece um modelo para avaliar as interações patógeno-hospedeiro iniciais para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese.

Abstract

Entamoeba histolytica é o agente causador da amebíase humana, uma das principais causas de diarréia e abscesso hepático em países tropicais. A infecção inicia-se por interacção do agente patogénico com células epiteliais intestinais. Essa interação leva à ruptura das estruturas intercelulares, como junções apertadas (TJ). TJ garantir a vedação da camada epitelial para separar tecido hospedeiro do lúmen intestinal. Estudos recentes fornecem evidências de que a interrupção do TJ pelo EhCPADH112 proteína parasitária é um pré-requisito para E. invasão histolytica que é acompanhada por disfunção da barreira epitelial. Assim, a análise dos mecanismos moleculares envolvidos na TJ desmontagem durante E. invasão histolytica é de suma importância para melhorar a nossa compreensão da amebíase patogênese. Este artigo apresenta um modelo simples que permite a avaliação das interações iniciais patógeno-hospedeiro eo potencial de invasão do parasita. Os parâmetros a serem analisados ​​incluem tresistência eléctrica ransepithelial, interacção de EhCPADH112 com receptores da superfície do epitélio, as alterações na expressão e localização de marcadores epiteliais juncionais e localização das moléculas do parasita no interior das células epiteliais.

Introduction

Entamoeba histolytica é um protozoário única célula responsável da amebíase humano, uma infecção intestinal causando inflamação e diarréia. E. histolytica infecta até 50 milhões de pessoas por ano, mas apenas cerca de 10% das pessoas infectadas desenvolvem os sintomas associados a amebíase 1. A infecção ocorre após a ingestão de alimentos contaminados ou água contendo E. cistos histolytica. No intestino, os cistos produzir trofozoítos vivos que aderem a mucina do cólon e proliferam 2. Trofozoítos geralmente formam cistos que são excretados via fezes. Em outros casos, e por razões ainda desconhecidas, trofozoítos quebrar a camada epitelial intestinal e invadir os tecidos subjacentes. No pior dos casos, eles entram na corrente sanguínea e afetar outros órgãos como o fígado 3.

Quebrando a barreira epitelial requer rompimento de estruturas epiteliais transmembranares que mantêm as células unidas. Célula epitelialos contactos são formados pelo complexo de junções de apicais consistindo apertado (TJ) e conexões aderentes (AJ), e 4 desmossomas. As junções mais apicais são TJ e, por isso, eles são a primeira barreira afrontado por E. histolytica e alguns outros agentes patogénicos durante a invasão de host. TJ são compostos de receptores de adesão transmembranares como claudinas, occludin e moléculas de adesão juncional (JAM) que se envolvem em interações heterofílicos homo ou com os receptores da célula vizinha. Eles são intracelularmente ligados por moléculas de andaime dos occludens zonula (ZO) da família de receptores de adesão que se ligam ao citoesqueleto de actina para proporcionar mais resistência mecânica ao epitélio. TJ são responsáveis ​​pela vedação do tecido intestinal do lúmen intestinal, evitando excesso de água e vazamento de soluto. Assim, depois de TJ são interrompidos pelo parasita, os tecidos são invadidos. E. histolytica segrega várias moléculas, tais como: (i) aqueles que estão envolvidos na adesão de amebas para alvet células 5; (Ii) fatores de membrana ativa participação em morte de células hospedeiras por exocitose, por exemplo, os peptídeos que formam os canais de íon denominado amebaporos 6,7; e (iii) as proteinases que degradam as proteínas da matriz extracelular e tecido mediam desintegração 5,8,9.

A protease de cisteína EhCP112 e a molécula de adesão EhADH112 que em conjunto formam o complexo EhCPADH112 são dois E. histolytica virulência proteínas que desempenham um papel importante na desmontagem de TJ 10. Trofozoítos vivo, seus lisados ​​totais e produtos secretados induzir alterações moleculares no TJ distúrbio complexo e funcional da barreira epitelial. Neste estudo, demonstra-se que EhCP112 e EhADH112 interagir com ocludina e claudina-1 de proteínas que conduzem à internalização e a degradação das proteínas celulares, facilitando, assim, E. entrada histolytica através da via paracelular.

Os dados e os óf outros grupos 11-17 sugerem fortemente a necessidade de interações patógeno-hospedeiro específicas que permitem a invasão do parasita. Desvendando as bases moleculares destas interações é de extrema importância para uma melhor compreensão da patogênese amebíase. Perturbação selectiva dos TJ por trofozoítos, caracterizado pelo aumento da permeabilidade paracelular, pode ser medido por uma diminuição da resistência eléctrica transepitelial (TER). A transferência de proteínas de parasitas no sentido epitélios host podem ser determinada por imunofluorescência e por microscopia confocal a laser, um método que também pode revelar a co-localização de factores de virulência ameba com marcadores juncionais epiteliais indicando possíveis interacções directas. Neste artigo, vamos descrever em detalhes como células epiteliais e trofozoítos são cultivadas, colhidas e manipuladas para examinar as interações patógeno-hospedeiro e suas consequências.

Protocol

1. Estabelecimento e Manutenção de E. Culturas histolytica Crescer com culturas puras (totalmente livre de todos os outros organismos contaminantes) 1 x 10 5 trofozoítos de Entamoeba histolytica HML tensão: IMSS clonar um 18 em 16 x 125 mm tubos de cultura com tampas de rosca de teflon forro (ou 1 x 10 6 trofozoítos em um descartável T- 25 frascos) e 15 ml (ou 50 ml em frascos T-25) de TYI-S-33 médio (caldo de TYI, suplementado com 3% de vitam…

Representative Results

Para uma E. sucedida cultura histolytica, duas condições importantes devem ser cumpridas: o crescimento em condições axênicas e colheita em fase logarítmica. Anteriormente, culturas de E. histolytica foram prontamente estabelecido em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos 22. No entanto, hoje em dia é comum ter cultivo axênico deste parasita que significa uma subcultura indefinido de amebas em um ambiente livre de bactérias que metabolizam, f…

Discussion

Para o estudo in vitro interações patógeno-hospedeiro durante a infecção epitelial pelo E. histolytica, é fundamental para trabalhar com culturas bem estabelecidas de ambas as células epiteliais e trofozoítos. Por exemplo, antigamente, E. culturas histolytica geralmente tinha sido estabelecida em associação com certas espécies de bactérias ou tripanossomatídeos 22,23. No entanto, a co-cultura de E. culturas histolytica é contraproducente para…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

This work was supported by grants from the Institute of Science and Technology of the Federal District (ICyTDF, 64/2012 to EO) and the Mexican Council for Science and Technology (Conacyt, 179895 to MS).

Materials

Entamoeba histolytica HM1:IMSS, Clone A  IMSS Hospital, Mexico Without/number Virulent trophozoites18 
TYI broth Becton, Dickinson and Company
Merck
Merck
Merck
J.T. Baker
Reproquifin
SIGMA-Aldrich
SIGMA-Aldrich
211862
K35625437 626
21578
4873
3252-01
CAS 50-81-7
C7880
F-5879
3.45% BBL Biosate peptone
58 mM glucose
39 mM NaCl
5 mM KH2PO4
6.5 mM K2HPO4
16.3 mM ascorbic acid
8.1 mM L-cysteine
 0.1 mM ferric ammonium citrate, adjust pH 6.819
Bovine serum adult Microlab , Labs., Mex. SU146 Use at 10% and inactivated to 56° C for 30 min
Diamond  vitamin  mixture- Tween 80 In vitro SR-07 Use at 3%
Penicillin  Lakeside,  Méx. 34564SSA IV 0.5 IU/mL
Streptomycin  Lakeside,  Méx. 75757SSA IV 35 µg/ mL
Pyrex 15 mL screw cap culture tubes with PTFE lined phenolic caps Corning-Pyrex 9826-16X 16×125 mm, capacity 15 mL and caps fabricated from special formula resistant to effects of temperature
Cell culture plates, 6 Well Corning-Costar 3516 Sterile plates, well diameter 34.8 mm and growth area 9.5 cm2.  Rings on lid prevent cross-contamination
25cm2 cell culture flask Corning-Costar 430168 Canted neck flasks
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I American Type Culture Collection CCL34 Kidney epithelial cells grown between the 60th and 90th passage
DMEM medium  Gibco  12800-017 Dulbecco's Modified Eagle Medium with high glucose.
Neonate Calf Serum In vitro S-02 Use at 10%.  
Penicillin/Streptomycin mixture  In vitro  A-01 Stock solution 10,000 U/µg/mL
Insulin   AMSA 398MJ94SSA IV Stock solution 100 IU/mL
Trypsin solution  In vitro EN-005 0.05% enzyme solution without calcium and magnesium
75cm2 cell culture flask Corning-Costar 430720 Canted neck flasks for trophozoite culture in TYI-S-33 medium
Transwell permeable supports Corning-Costar 3470 0.4. µm polyster membrane, 6.5 mm insert in 24 well plate, growth area 0.3 cm2
24 well cell culture dish   Corning-Costar 3524 Clear polystyrene, treated for optimal cell attachment, sterilized by gamma radiation and certified non-pyrogenic
Complete Mini Roche 11836 153 001 Protease inhibitor cocktail inhibits a broad spectrum of serine, cysteine and metallo-proteases. Final concentration 1 mM 
Trans-epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64) SIGMA-Aldrich E3132 Cystein protease inhibitor, final concentration 40 µg/mL
pαZO-1  Invitrogen 402200 IgG rabbit policlonal  antibody  against  a synthetic peptide in the middle region of the ZO-1 human protein
mαEhCPADH112 Homemade antibody Without/ Number IgM mouse monoclonal antibody  against  444-601 epitope located at C-terminal of EhCPADH11221,27
FITC-goat anti-mouse IgM Zymed 62-6811 Fluorescein isotiocyanate (FITC)-labelled goat anti-mouse secondary  antibody
TRITC- goat anti-rabbit IgG (H+L) Zymed 816114 Tetramethyl-rhodamine isothiocyanate (TRITC)-labelled  goat anti-rabbit IgG  secondary antibody.
STX2 Electrode World Precision Instrument  102711 Consists of a fixed pair of double electrodes, 4 mm wide and 1 mm thick. Each stick of the electrode pair contains a silver/silver-chloride pellet for measuring voltage and a silver electrode for passing current. For use with EVOM
EVOM epithelial voltohmmeter World Precision Instrument  12111 Use in resistance mode and maintain unplugged during TER measurements
Neubauer chamber MEARIENFELD 610610 Hemocytometer 
Leica TCS_SP5_MO Leica Without/number Laser confocal microscopy with Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield Vector Laboratories, Inc. H-1000 Mounting medium for fluorescence
4´, 6-diamino-2-phenylindole (Dapi) SIGMA D-9542 0.05 mM final concentration
Bovine serum albumin (BSA) US Biological A-1310 0.5%  final concentration for blocking solution

References

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Citer Cet Article
Betanzos, A., Schnoor, M., Javier-Reyna, R., García-Rivera, G., Bañuelos, C., Pais-Morales, J., Orozco, E. Analysis of the Epithelial Damage Produced by Entamoeba histolytica Infection. J. Vis. Exp. (88), e51668, doi:10.3791/51668 (2014).

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