רומן<em> In vivo</em> טכניקה וין העברה<em> במבחנה</emמבחני תא בהתבסס> לחקר אובדן עצם בפרעות השלד והשרירים
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
מחלות השלד והשרירים משפיעות על מיליוני אנשים בארצות הברית וההשלכות חמורות בהווה למערכות בריאות מקומיות וארציות 1. הפרעות אלו מתאפיינות באובדן העצם ותפקוד מפרקים הדורשים טיפול מקיף ותקופות של התאוששות ארוכות. בדרך כלל, גידול יחסי במספר ו / או הפעילות של osteoclasts, תאים מתמחים לנספגים שוב עצם, באוסטיאופורוזיס ובדלקת מפרקים שהוא ציין 2. בתנאים פיסיולוגיים במספר ובפעילות של osteoclasts מוסדר על ידי מפעיל הקולטן של הגורם הגרעיני κ-B ליגנד (RANKL), אשר מופק על ידי אוסטאובלסטים. Osteoprotegerin (OPG), קולטן דמה לRANKL מיוצר גם על ידי osteoblasts 3 בvivo מודלים של בעלי חיים הכרוכים בביטוי יתר מערכתי של sRANKL, או מחיקה של OPG יקרים מאוד במחקר באוסטאופורוזיס.; עם זאת, שיטות אלו דורשות הדור של עכברים הטרנסגניים 4,5. כאן, אלטרנטיבה רומןשיטה של overexpressing sRANKL לחקר הפרעות הקשורות לשרירים ושלד מתואר. באופן ספציפי, minicircle (MC) טכנולוגיית ה-DNA ושיטות משלוח הידרודינמית שימשו כדי להשיג העברת גנים של sRANKL in vivo ו overexpress עכבר sRANKL מערכתי 6.
שיטה זו היא גם משלימה in vivo מודלים אחרים לאוסטאופורוזיס, כגון אפנון הורמונלי של osteoclasts הבא ovariectomy 7 והתערבות תזונתית על ידי דיאטה דל בסידן 8. מודלים אלה הם מאוד שימושיים כדי ללמוד היבטים שונים של הפרעות הקשורות לשלד ושרירים עם זאת הם דורשים ניתוחים ועשויים להימשך עד מספר חודשים, במחיר משמעותי 9. מודל מכרסם ovariectomized (OVX) הוא מודל חיה ניסיוני שבו הסרת השחלות גורמת למחסור באסטרוגן ובכך מחקה אוסטאופורוזיס לאחר גיל המעבר אדם 10. אוסטיאופורוזיס בגיל הבלות אדם, מצב שבו defici אסטרוגןency מוביל לסיכון מוגבר לשברים בעצמות ובריחת סידן משפיעה על כשמונה מיליון נשים בארצות הברית לבדה. למרות שמודל OVX שימושי לאוסטיאופורוזיס בגיל הבלות הוא מציע יתרונות מוגבלים בלימוד אוסטאופורוזיס באופן כללי. אסטרוגן מדכא את איבוד מסת עצם, על ידי גרימת osteoclast ועיכוב אפופטוזיס osteoblast, ולכן בהעדרה פעילות osteoclast המוגבר הוא ציין 10-12. חוסר איזון יחס RANKL-OPG שמעדיף ספיגת עצם הוא ציין גם 13. עם זאת, מחסור באסטרוגן in vivo מלווה גם בירידה ברמות של הפיכת β גורם גדילה (β TGF), גדל אינטרלויקין 7 (IL-7) וTNF, IL-1 ו-IL-6 14,15. כציטוקינים אלה ידועים פונקציות ויסות שיפוץ עצם בלתי תלויות במסלול RANKL, אי אפשר לייחס כל הפעלת osteoclast אך ורק על ציר RANKL-RANK. המודל המתואר במאמר זה מאפשר לחוקרים ללמוד ביוo ציר RANKL-RANK בosteoclastogenesis ואובדן עצם ללא הפרו ציטוקינים דלקתיים בהשוואה למודלים של מכרסמים OVX.
בנוסף, טכניקות osteoclastogenesis במבחנה הן כלים חיוניים ללמוד הפעלת osteoclast לטיפולי פוטנציאל טיפוליים של מחלות השלד והשרירים. גם מחקרים קודמים הראו כי culturing מקרופאגים מח עצם עכבר נגזרים (BMMs) עם גורם מקרופאג העכבר מגרה מושבה (M-CSF) והעכבר sRANKL יכול להוביל לבידול osteoclast 3,16,17. הנה, את הפרוטוקולים כדי לייצר תאים כמו osteoclast-multinucleated ממח העצם של עכבר, כמו גם מהתאים אנושיים היקפיים mononuclear הדם (PBMCs) במבחנה 18 מתוארים. מבחני מבוססי התאים נדרשים להגדיר osteoclast הבדיל סופני ומתפקד באופן מלא בשלה גם מתוארים בקצרה. במבחנה טכניקות אלה משלימים את הרומן בגישת vivo ויחד לשמש pכלי החקירה owerful ללמוד בידול osteoclast והפעלה. שימוש במערכות אלה, מדענים מסוגלים לייצר osteoclasts in vivo ו במבחנה ולהגדיר את הגירויים ואותות הנדרשים להפצה וההפעלה שלהם, כמו גם לבחון את היעילות של מעכבים תרופתיים וביולוגיים.
Protocol
Representative Results
Discussion
תנאי השלד והשרירים מובילים גורמים לתחלואה ונכות ומורכבים של מעל 150 מחלות ותסמונות; המשפיע על כ -90 מיליון אמריקאים היום. דלקת מפרקים והרס עצם הם תכונות העיקריות של תנאים שרירי שלד, הכוללים דלקת מפרקים ואוסטאופורוזיס. אוסטאופורוזיס היא מחלה שמחלישה את שלמות עצם, לעתים ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis – a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
