小説<em> in vivoで</em>遺伝子導入技術と<em> in vitroで</em筋骨格障害における骨損失の検討のための>細胞ベースのアッセイ
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
筋骨格系疾患は、米国および国や地域の保健システムの1のために存在深刻な結果に何百万人もの人々に影響を与えます。これらの疾患は、骨の損失および広範な治療および回復の長い期間を必要とする関節機能によって特徴付けられる。一般に、数および/ または骨粗鬆症および関節炎では、骨を吸収する破骨細胞特化し、細胞の活性の相対的増加が観察される2。生理学的条件下で破骨細胞の数および活性は、骨芽細胞により産生される核因子κ-Bリガンド（RANKL）の受容体活性化によって調節される。オステオプロテゲリン（OPG）、RANKLのためのデコイ受容体はまた、骨芽3によって生成される全身sRANKLの過剰発現、又はOPGの欠失を含むインビボ動物モデルは、骨粗しょう症の研究に非常に有用である。;しかしながら、これらの方法は、トランスジェニックマウス、4,5の発生を必要とする。ここでは、新たな代替筋骨格関連疾患の研究のためのsRANKLを過剰発現させる方法が記載されている。具体的には、ミニサークル（MC）DNA技術および流体力学的送達方法は、インビボで sRANKLの遺伝子導入を達成し、全身6マウスsRANKLを過剰発現するために使用した。
この方法はまた、低カルシウム食8により卵巣切除7および食事介入後の破骨細胞のホルモンの変調のような骨粗鬆症の他のin vivoモデルに対して相補的である。これらのモデルは、しかし、彼らは外科手術を必要とし、大幅なコスト9で、数ヶ月かかることがあり筋骨格関連障害のさまざまな側面を研究することは非常に便利です。卵巣摘出（OVX）げっ歯類モデルは卵巣の除去は、それによって人間の閉経後骨粗しょう症10を模倣するエストロゲン欠乏につながる実験動物モデルである。人間の閉経後骨粗しょう症、条件エストロゲン欠乏症encyは骨折のリスクの増加につながり、骨粗しょう症は、米国だけで約8万人の女性に影響を与えます。 OVXモデルは、閉経後の骨粗しょう症のために有用であるが、それは一般的に骨粗しょう症の研究に限定された利点を提供しています。エストロゲンは、したがって、その非存在下で破骨細胞活性の増加が観察される10〜12、破骨細胞を誘導し、骨芽細胞のアポトーシスを阻害することによって、骨損失を抑制する。骨吸収に有利RANKL-OPG比の不均衡13も観察される。しかしながら、 インビボでのエストロゲン欠乏はまた、を伴う成長因子β（TGFのβ）のレベルを減少させ、インターロイキン-7（IL-7）、TNF、IL-1およびIL-6 14,15が増加した。これらのサイトカインは、RANKL経路の骨リモデリングの調節機能が独立した知っていたとして、それは単に、RANKL-RANK軸に任意の破骨細胞活性化を帰属させることは不可能である。このホワイトペーパーで説明されたモデルは、VIVに留学する研究者を可能にしますO前炎症性サイトカインのない破骨細胞形成および骨量の減少におけるRANKL-RANK軸は、OVX齧歯類モデルと比較。
また、in vitroでの破骨細胞形成技術は、筋骨格疾患の潜在的な治療的処置のために、破骨細胞の活性化を研究するために不可欠なツールです。以前の研究は、マウスのマクロファージコロニー刺激因子（M-CSF）でマウス骨髄由来マクロファージ（BMMS）を培養し、マウスsRANKLが破骨細胞分化3,16,17につながることが示されている。ここで、マウスの骨髄から、ならびにインビトロ18ヒト末梢血単核細胞（PBMC）からの多核破骨細胞様細胞を生成するためのプロトコルが記載されている。成熟した終末分化して完全に機能する破骨細胞を定義するために必要な、細胞ベースのアッセイも簡単に説明している。これらのインビトロ技術は、生体内のアプローチで小説を補完し、一緒にPとして機能owerful調査ツールは、破骨細胞の分化および活性化を研究する。これらのシステムを使用して、科学者は、 インビボおよびインビトロで破骨細胞を生成し、それらの増殖および活性化に必要な刺激および信号を定義するだけでなく、薬理学的および生物学的阻害剤の有効性を試験することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
筋骨格条件は、罹患率と障害の原因をリードしているし、150以上の疾患や症候群で構成されます。今日は約90万人のアメリカ人に影響を与える。関節の炎症や骨の破壊性関節炎や骨粗しょう症などの筋骨格症状の主な機能です。骨粗しょう症は、多くの場合、骨の骨折につながる骨の整合性を弱める条件である。関節炎は腫れ、圧痛およびスティッフ制限通常の移動となり、障害につながる?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
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