رواية<em> في الجسم الحي</em> تقنيات نقل الجينات و<em> في المختبر</em> فحوصات وبناء خلية لدراسة فقدان العظام في اضطرابات العضلات والعظام
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
أمراض العضلات والعظام تؤثر على الملايين من الناس في الولايات المتحدة وعواقب وخيمة الحاضر على النظم الصحية الوطنية والمحلية 1. وتتميز هذه الاضطرابات بسبب فقدان العظام وظيفة مشتركة التي تتطلب معالجة مكثفة وفترات طويلة من الانتعاش. عادة، زيادة نسبية في عدد و / أو نشاط الخلايا الآكلة، وخلايا متخصصة ليرتشف العظام، في ترقق العظام والتهاب المفاصل لوحظ 2. في ظل الظروف الفسيولوجية وينظم عدد ونشاط الخلايا الآكلة بواسطة مستقبلات عامل منشط النووية κ-B يجند (RANKL)، الذي تنتجه الخلايا بانية العظم. Osteoprotegerin (OPG)، وينتج مستقبلات شرك لRANKL أيضا بانيات 3 في الجسم الحي النماذج الحيوانية التي تنطوي من overexpression النظامية من sRANKL، أو حذف OPG هي قيمة للغاية في مجال البحوث هشاشة العظام.؛ ومع ذلك، وهذه الأساليب تتطلب جيل من الفئران المعدلة وراثيا 4،5. هنا، بديل الروايةيوصف أسلوب overexpressing sRANKL لدراسة الاضطرابات المرتبطة العضلات والعظام. على وجه التحديد، واستخدمت minicircle (MC) تكنولوجيا الحمض النووي وطرق التسليم الهيدروديناميكية لتحقيق نقل الجينات من sRANKL في الجسم الحي وoverexpress الماوس sRANKL جهازيا 6.
هذا الأسلوب هو أيضا مكملة للأخرى في الجسم الحي نماذج من ترقق العظام، مثل التشكيل الهرمونية من الآكلة التالية استئصال المبيض 7 والتدخل الغذائي من خلال اتباع نظام غذائي منخفض الكالسيوم 8. هذه النماذج هي مفيدة جدا لدراسة جوانب مختلفة من الاضطرابات العضلية الهيكلية ذات الصلة إلا أنها تتطلب عمليات جراحية ويمكن أن يستغرق فترة تصل الى عدة أشهر، بتكلفة كبيرة 9. مستأصلة المبيض (وفك) نموذج القوارض هو نموذج على حيوانات التجارب حيث إزالة المبايض يؤدي إلى نقص هرمون الاستروجين بعد سن اليأس وهشاشة العظام وبالتالي محاكاة الإنسان 10. الإنسان بهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث، شرط فيها هرمون الاستروجين deficiency يؤدي إلى زيادة خطر كسور العظام وهشاشة العظام يؤثر على ما يقرب من ثمانية ملايين امرأة في الولايات المتحدة وحدها. على الرغم من أن نموذج وفك مفيد لهشاشة العظام بعد انقطاع الطمث أنه يوفر مزايا محدودة في دراسة هشاشة العظام بشكل عام. الاستروجين يمنع فقدان العظام، عن طريق حفز ناقضة العظم وتثبيط بناء العظم موت الخلايا المبرمج، وبالتالي في غيابها لوحظ زيادة النشاط ناقضة العظم 10-12. ويلاحظ وجود RANKL-OPG نسبة الخلل الذي يفضل ارتشاف العظام أيضا 13. ومع ذلك، ويرافق نقص هرمون الاستروجين في الجسم الحي أيضا من انخفاض مستويات عامل النمو تحويل β (TGF β)، وزيادة انترلوكين 7 (IL-7) وTNF، IL-1 و IL-6 14،15. لأن هذه السيتوكينات قد عرفت وظائف تغييري إعادة تشكيل العظام مستقلة عن المسار RANKL، فإنه من المستحيل أن ينسب أي تفعيل ناقضة العظم فقط إلى المحور RANKL رتبة. نموذج صفها في هذه الورقة تمكن الباحثون للدراسة في فيفس محور RANKL رتبة في osteoclastogenesis وفقدان العظام دون السيتوكينات الموالية للالتهابات مقارنة نماذج القوارض وفك.
بالإضافة إلى ذلك، في المختبر تقنيات osteoclastogenesis هي أدوات أساسية لدراسة تفعيل ناقضة العظم لعلاج العلاجية المحتملة للأمراض العضلات والعظام. وقد أظهرت الدراسات السابقة أيضا أن زراعة نخاع العظم الضامة الماوس المستمدة (BMMs) مع الماوس بلعم مستعمرة عامل تحفيز (M-CSF) والماوس sRANKL يمكن أن تؤدي إلى التمايز ناقضة العظم 3،16،17. هنا، يتم وصف البروتوكولات لتوليد الخلايا ناقضة العظم مثل الماوس متعددة النوى من نخاع العظم وكذلك من الخلايا المحيطية وحيدات النوى الإنسان الدم (PBMCs) في المختبر 18. كما وصفها بإيجاز المقايسات خلية مقرها المطلوبة لتحديد ناقضة العظم متباينة عضال وتعمل بكامل طاقتها ناضجة. هذه في المختبر تقنيات تكمل الرواية في الجسم الحي والنهج معا بمثابة عأدوات التحقيق owerful لدراسة التمايز ناقضة العظم والتنشيط. باستخدام هذه الأنظمة، والعلماء قادرون على توليد الخلايا الآكلة في الجسم الحي في المختبر وتحديد المحفزات والإشارات اللازمة لانتشارها وتفعيل وكذلك اختبار فعالية مثبطات الدوائية والبيولوجية.
Protocol
Representative Results
Discussion
ظروف العضلات والعظام تقود أسباب الاعتلال والعجز وتتألف من أكثر من 150 من الأمراض والمتلازمات؛ التي تؤثر على ما يقرب من 90 مليون أميركي اليوم. التهاب المفاصل وتدمير العظام هي السمات الغالبة من الحالات العضلية الهيكلية، بما في ذلك التهاب المفاصل وهشاشة العظام. هشاشة الع…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis – a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
