A Novel<em> In vivo</em> Technique Gene Transfer et<em> In vitro</em> Essais cellule sur la base de l'étude de la perte osseuse dans les troubles musculo-squelettiques
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
Maladies musculo-squelettiques affectent des millions de personnes aux Etats-Unis et actuelles de graves conséquences pour les systèmes nationaux et locaux de la santé 1. Ces troubles sont caractérisés par la perte de l'os et la fonction articulaire qui nécessitent un traitement lourd et de longues périodes de récupération. Généralement, une augmentation relative du nombre et / ou l'activité des ostéoclastes, cellules spécialisées à résorber l'os, l'ostéoporose et l'arthrite est observée 2. Dans des conditions physiologiques, le nombre et l'activité des ostéoclastes est régulée par l'activateur du récepteur du facteur nucléaire-κ B ligand (RANKL), qui est produit par les ostéoblastes. Ostéoprotégérine (OPG), un récepteur leurre pour RANKL est également produite par les ostéoblastes 3 Dans les modèles animaux in vivo qui impliquent la surexpression systémique de sRANKL, ou la suppression d'OPG sont très précieux dans la recherche de l'ostéoporose.; Cependant, ces méthodes nécessitent la génération de souris transgéniques à 4,5. Ici, une nouvelle alternativeméthode de surexpression sRANKL pour l'étude des troubles musculo-squelettiques liés est décrite. Plus précisément, minicercles (MC) technologie de l'ADN et les méthodes de livraison hydrodynamiques ont été utilisés pour réaliser le transfert de gènes in vivo de sRANKL et surexpriment la souris sRANKL systémique 6.
Cette méthode est également complémentaire à d'autres modèles in vivo de l'ostéoporose, tels que la modulation hormonale des ostéoclastes suivants ovariectomie 7 et l'intervention diététique par le régime alimentaire pauvre en calcium 8. Ces modèles sont très utiles pour étudier les différents aspects des troubles musculo-squelettiques liés-mais ils ont besoin d'interventions chirurgicales et peuvent prendre jusqu'à plusieurs mois, à un coût important 9. Ovariectomisées (OVX) modèle de rongeur est un modèle animal expérimental où l'enlèvement des ovaires conduit à une déficience en oestrogènes mimant ainsi l'ostéoporose post-ménopausique humaine 10. Human ostéoporose post-ménopausique, une condition où l'oestrogène Deficirence conduit à un risque accru de fractures osseuses et l'ostéoporose affecte environ huit millions de femmes aux États-Unis seulement. Bien que le modèle OVX est utile pour l'ostéoporose post-ménopausique il offre des avantages limités à l'étude de l'ostéoporose en général. L'œstrogène inhibe la perte osseuse, en induisant des ostéoclastes et en inhibant l'apoptose des ostéoblastes, donc en l'absence d'une augmentation de l'activité des ostéoclastes est observée 10 à 12. Un rapport RANKL-OPG déséquilibre qui favorise la résorption osseuse est également observée 13. Cependant, la carence en oestrogène in vivo est également accompagnée par des niveaux de transformation β du facteur de croissance (TGF β d'), l'augmentation de l'interleukine-7 (IL-7) et le TNF, IL-1 et IL-6 14,15 diminué. Comme ces cytokines ont connu des fonctions modulatrices du remodelage osseux indépendante de la voie de RANKL, il n'est pas possible d'attribuer toute activation des ostéoclastes uniquement à l'axe RANKL-RANK. Le modèle décrit dans ce document permet aux chercheurs d'étudier en vivo axe RANKL-RANK dans ostéoclastogénèse et la perte osseuse sans cytokines pro-inflammatoires par rapport aux modèles de rongeurs OVX.
En outre, les techniques in vitro ostéoclastogenèse sont des outils essentiels pour étudier l'activation des ostéoclastes pour des traitements thérapeutiques potentielles des maladies musculo-squelettiques. Des études antérieures ont également montré que la culture de macrophages de souris dérivées de la moelle osseuse (BMMS) avec des macrophages de souris colony-stimulating factor (M-CSF) et de la souris sRANKL peut conduire à la différenciation des ostéoclastes 3,16,17. Ici, les protocoles pour générer des cellules ostéoclastes multinucléés analogue à partir de moelle osseuse de souris, ainsi que de cellules mononucléaires périphériques humaines du sang périphérique (PBMC) in vitro 18 sont décrits. Les tests cellulaires nécessaires pour définir un ostéoclastes différenciation terminale et entièrement fonctionnel maturité sont aussi brièvement décrits. Ces techniques in vitro complètent la nouvelle approche in vivo et, ensemble, servent de poutils d'investigation owerful pour étudier la différenciation des ostéoclastes et activation. L'utilisation de ces systèmes, les scientifiques sont capables de générer des ostéoclastes in vivo et in vitro et de définir les stimuli et les signaux nécessaires à leur prolifération et l'activation ainsi que de tester l'efficacité des inhibiteurs pharmacologiques et biologiques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Troubles musculo-squelettiques sont les principales causes de morbidité et d'invalidité et sont constitués de plus de 150 maladies et syndromes; affectant environ 90 millions d'Américains aujourd'hui. L'inflammation des articulations et la destruction osseuse sont des caractéristiques prédominantes de troubles musculo-squelettiques, dont l'arthrite et l'ostéoporose. L'ostéoporose est une maladie qui fragilise l'intégrité de l'os, ce qui conduit souvent à des fractures de l&…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
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