A Novel<em> In vivo</em> Gentransfer-Technik und<em> In-vitro-</em> Zellbasierte Assays für das Studium der Knochenverlust in Skeletterkrankungen
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
Muskel-Skelett-Erkrankungen betreffen Millionen von Menschen in den Vereinigten Staaten und Gegenwart schwerwiegende Folgen für die nationalen und lokalen Gesundheitssysteme ein. Diese Erkrankungen sind durch den Verlust von Knochen-und Gelenkfunktion, die umfangreiche Behandlung und lange Erholungsphasen erfordern gekennzeichnet. Üblicherweise wird eine relative Erhöhung der Anzahl und / oder Aktivität von Osteoklasten, spezialisierte Zellen zu Knochenresorption, Osteoporose und Arthritis beobachtet 2. Unter physiologischen Bedingungen ist die Anzahl und Aktivität von Osteoklasten durch Rezeptor-Aktivator-von Kernfaktor κ-B-Liganden (RANKL), die von Osteoblasten produziert wird geregelt. Osteoprotegerin (OPG), wird ein Köder Rezeptor für RANKL auch durch Osteoblasten 3 erzeugten In-vivo-Tiermodelle, die systemische Überexpression von sRANKL oder Deletion von OPG einzubeziehen sind sehr wertvoll bei Osteoporose-Forschung. Allerdings erfordern diese Verfahren die Herstellung von transgenen Mäusen 4,5. Hier wird eine neuartige AlternativeVerfahren überexprimieren sRANKL für die Untersuchung von Muskel-Skelett-bedingten Erkrankungen beschrieben. Insbesondere Minicircle (MC) DNA-Technologie und hydrodynamischen Versandmethoden wurden verwendet, um Gen-Transfer von sRANKL in vivo zu erreichen und überexprimieren Maus sRANKL systemisch 6.
Diese Methode ist auch eine Ergänzung zu anderen in-vivo-Modelle von Osteoporose, wie hormonelle Modulation der Osteoklasten folgenden ovariectomy 7 und diätetische Intervention durch kalziumarme Ernährung 8. Diese Modelle sind sehr nützlich, um verschiedene Aspekte des Bewegungsbedingten Störungen aber sie erfordern chirurgische Verfahren und kann bis zu mehreren Monaten, was mit erheblichen Kosten 9 studieren. Ovariektomierte (OVX) Nagetier-Modell ist ein Modell, bei dem Versuchstier Entfernung der Eierstöcke führt zu Östrogenmangel, wodurch menschliche postmenopausalen Osteoporose 10 imitiert. Menschen postmenopausalen Osteoporose, eine Erkrankung, bei Östrogen deficirenz führt zu einem erhöhten Risiko von Knochenbrüchen und Osteoporose rund acht Millionen Frauen allein in den Vereinigten Staaten. Obwohl die OVX Modell ist nützlich für postmenopausalen Osteoporose bietet begrenzte Vorteile bei der Untersuchung von Osteoporose im Allgemeinen. Östrogen unterdrückt Knochenverlust, durch Induktion von Osteoklasten und Osteoblasten Hemmung der Apoptose, also in seiner Abwesenheit eine erhöhte Aktivität der Osteoklasten beobachtet 10-12. Ein RANKL-OPG-Verhältnis Ungleichgewicht, das die Knochenresorption begünstigt wird auch beobachtet, 13. Jedoch Östrogenmangel in vivo auch begleitet von verringerten Niveaus des transformierenden Wachstumsfaktor β (TGF β), erhöhte Interleukin-7 (IL-7) und TNF, IL-1 und IL-6 14,15. Da diese Zytokine Knochenumbau modulatorische Funktionen der RANKL Weg unabhängig bekannt ist, ist es unmöglich, eine Osteoklastenaktivierung nur auf die RANKL-RANK-Achse zuzuordnen. Die in diesem Dokument beschriebene Modell ermöglicht es Forschern, in viv studierenRANKL-RANK-o-Achse in Osteoklastogenese und Knochenverlust ohne pro-inflammatorischen Zytokinen im Vergleich zu OVX Nagetiermodellen.
Zusätzlich kann in vitro Osteoklastogenese Techniken sind wesentliche Instrumente zur Aktivierung der Osteoklasten für mögliche therapeutische Behandlungen von Muskel-Skelett-Erkrankungen zu studieren. Frühere Studien haben auch gezeigt, dass die Kultivierung Knochenmark der Maus Makrophagen (BMM) mit Maus-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF) und Maus sRANKL können, um die Differenzierung von Osteoklasten 3,16,17 führen. Hier werden die Protokolle kernige Osteoklasten-ähnliche Zellen aus Maus-Knochenmark sowie aus menschlichen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) in vitro zu erzeugen 18 beschrieben. Die zellbasierte Assays erforderlich, um eine reife terminal differenzierten und voll funktions Osteoklasten definieren ebenfalls kurz beschrieben. Diese in-vitro-Techniken ergänzen den Roman in vivo Ansatz zusammen und dienen als powerful Untersuchungswerkzeuge, um die Differenzierung von Osteoklasten und Aktivierung zu studieren. Mit Hilfe dieser Systeme sind die Wissenschaftler in der Lage, die Osteoklasten in vivo und in vitro zu erzeugen und definieren Sie die Reize und Signale für ihre Verbreitung und Aktivierung erforderlich sowie testen die Wirksamkeit von pharmakologischen und biologischen Inhibitoren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Erkrankungen des Bewegungsapparats sind die führenden Ursachen von Morbidität und Behinderung und werden von über 150 Krankheiten und Syndrome besteht; Auswirkungen auf heute etwa 90 Millionen Amerikaner. Gelenkentzündungen und Knochenzerstörung wiegen Merkmale Erkrankungen des Bewegungsapparats, einschließlich Arthritis und Osteoporose. Osteoporose ist eine Erkrankung, die Knochen schwächt Integrität, die häufig Frakturen der Knochen führt. Arthritis ist eine chronische, schwächende Erkrankung, die durch Ent…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
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