A Novel<em> In vivo</em> Tecnica Gene Transfer e<em> In vitro</em> test cellulari per lo studio della perdita ossea nei disturbi muscoloscheletrici

Summary

Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.

Abstract

Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.

Introduction

Malattie muscolo-scheletriche colpiscono milioni di persone negli Stati Uniti e presentare gravi conseguenze per i sistemi sanitari nazionali e locali ^1. Questi disturbi sono caratterizzati da perdita di osso e funzione articolare che richiedono un trattamento estensivo e lunghi periodi di recupero. Comunemente, un relativo aumento del numero e / o attività di osteoclasti, cellule specializzate a riassorbire osso, osteoporosi ed artrite si osserva ^2. In condizioni fisiologiche il numero e l'attività degli osteoclasti è regolata da attivatore del recettore del fattore nucleare κ-B ligando (RANKL), che è prodotto dagli osteoblasti. Osteoprotegerina (OPG), un recettore decoy per RANKL è anche prodotta dagli osteoblasti ³ In modelli animali in vivo che coinvolgono la sovraespressione sistemica di sRANKL, o la cancellazione di OPG sono molto prezioso nella ricerca sull'osteoporosi.; Tuttavia, questi metodi richiedono la generazione di topi transgenici ^4,5. Qui, una nuova alternativametodo di iperespressione sRANKL per lo studio dei disturbi muscoloscheletrici legati è descritto. In particolare, minicircle (MC) tecnologia del DNA e metodi di consegna idrodinamiche sono stati usati per conseguire trasferimento genico di sRANKL in vivo e iperespressione del mouse sRANKL sistemicamente ^6.

Questo metodo è anche complementare ad altri modelli in vivo di osteoporosi, come la modulazione ormonale degli osteoclasti seguenti ovariectomia ⁷ e intervento dietetico da basso contenuto di calcio dieta ^8. Questi modelli sono molto utili per studiare diversi aspetti dei disturbi muscoloscheletrici legati tuttavia essi richiedono procedure chirurgiche e può richiedere fino a diversi mesi, ad un costo significativo ^9. Ovariectomizzate (OVX) modello di roditore è un modello animale sperimentale in cui la rimozione delle ovaie porta alla mancanza di estrogeni mimando così postmenopausale umano ^10. Umano post-menopausa osteoporosi, una condizione in cui gli estrogeni deficirenza porta ad un aumento del rischio di fratture ossee e l'osteoporosi colpisce circa otto milioni di donne negli Stati Uniti da soli. Anche se il modello OVX è utile per l'osteoporosi post-menopausale che offre vantaggi limitati a studiare l'osteoporosi in generale. Estrogeni sopprime perdita ossea, inducendo osteoclasti e osteoblasti inibizione dell'apoptosi, quindi in sua assenza un aumento dell'attività degli osteoclasti si osserva ^10-12. Un rapporto di squilibrio RANKL-OPG che favorisce riassorbimento osseo si osserva anche ^13. Tuttavia, la carenza di estrogeni in vivo è accompagnato anche da una diminuzione dei livelli di fattore di crescita trasformante β (TGF β), aumento della interleuchina-7 (IL-7) e TNF, IL-1 e IL-6 ^14,15. Poiché queste citochine hanno conosciuto funzioni modulatori rimodellamento osseo indipendente dal percorso che RANKL, è impossibile attribuire qualsiasi osteoclasti esclusivamente all'asse RANKL-RANK. Il modello descritto in questo documento consente ai ricercatori di studiare in vivo l'asse RANKL-RANK in osteoclastogenesi e la perdita di osso senza citochine pro-infiammatorie rispetto ai modelli di roditori OVX.

Inoltre, le tecniche osteoclastogenesi in vitro sono strumenti essenziali per studiare l'attivazione degli osteoclasti per i potenziali trattamenti terapeutici delle malattie muscolo-scheletriche. Precedenti studi hanno inoltre dimostrato che la coltura di midollo osseo di topo macrofagi derivati ​​(BMMs) con il mouse macrofagi fattore stimolante le colonie (M-CSF) e il mouse sRANKL può portare a osteoclasti differenziazione ^3,16,17. Qui sono descritti i protocolli per generare cellule osteoclasti come multinucleate da midollo osseo di topo e di cellule mononucleari del sangue periferico (PBMC) in vitro ^18. I saggi cellulari necessari per definire un maturo osteoclasti terminalmente differenziate e pienamente funzionale sono anche descritte brevemente. Queste tecniche in vitro completano il romanzo di approccio vivo e insieme fungono da pstrumenti investigativi owerful per studiare la differenziazione degli osteoclasti e l'attivazione. L'utilizzo di questi sistemi, gli scienziati sono in grado di generare osteoclasti in vivo e in vitro e definire gli stimoli e segnali necessari per la proliferazione e l'attivazione e testare l'efficacia di inibitori farmacologici e biologici.

Protocol

1. Consegna idrodinamica di sRANKL MC DNA Consegna idrodinamica via Tail Vena del mouse Pesare il mouse prima dell'iniezione coda vena. Diluire sRANKL o proteina fluorescente verde (GFP) MC in soluzione di Ringer (pre-riscaldare a 37 ° C) in un volume totale di circa 10% del peso corporeo del topo. Riscaldare il topo in una gabbia per 10 min prima dell'iniezione per dilatare i vasi sanguigni e rendere vene laterali (LV) visibili. Monitorare con attenzione il mouse per evitare la di…

Representative Results

Qui, una tecnica di trasferimento nuovo gene per la differenziazione degli osteoclasti in vivo e protocolli di coltura cellulare per differenziare le cellule precursori in osteoclasti in vitro come metodo per studiare gli effetti di citochine sulla osteoclastogenesis sono descritti. In Figura 1, sono mostrati i risultati rappresentativi di successo trasferimento genico di GFP e mouse sRANKL MC nei topi. Nella figura 2, vengono mostrate le immagini rappresentative del m…

Discussion

Condizioni muscolo-scheletriche sono le cause principali di morbilità e di disabilità e sono composti da oltre 150 malattie e sindromi; che colpisce circa 90 milioni di americani oggi. L'infiammazione articolare e la distruzione ossea sono caratteristiche predominanti di disturbi muscolo-scheletrici, tra cui l'artrite e l'osteoporosi. L'osteoporosi è una condizione che indebolisce l'integrità ossea, causando spesso fratture delle ossa. L'artrite è una malattia cronica, debilitante malattia c…

Materials

alpha-MEM	Life Technologies	12561-056
Human M-CSF	Miltenyi Biotec	130-096-492
Mouse M-CSF	Miltenyi Biotec	130-094-643
Human RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-631
Mouse RANK-Ligand – soluble	Miltenyi Biotec	130-094-076
Tailveiner Restrainer for mice	Braintree	TV-150 STD
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit	R&D systems	MTR00
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit	Sigma	387A
MouseTRAP assay	immunodiagnostic systems	SB-TR103