Роман<em> В естественных условиях</em> Перенос генов Техника и<em> В пробирке</em> Сотовый основе Анализы для исследования костного Потери в опорно-двигательного аппарата
Summary
Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Abstract
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Introduction
Заболевания опорно-двигательного затрагивают миллионы людей в Соединенных Штатах и нынешних тяжелых последствий для национальных и местных систем здравоохранения 1. Эти расстройства характеризуются потерей костной и функции суставов, которые требуют серьезного лечения и длительные периоды восстановления. Как правило, относительное увеличение числа и / или активности остеокластов, клеток, специализирующихся на резорбируют кости, при остеопорозе и артрит наблюдается 2. В физиологических условиях количество и активность остеокластов регулируется рецептора активатора ядерного фактора κ-B лиганда (RANKL), который получают путем остеобластов. Остеопротегерин (ОПГ), рецептор приманка для RANKL также производится остеобластов 3 IN VIVO модели на животных, которые включают системную сверхэкспрессию sRANKL, или удаление ОПГ очень ценны в остеопороза исследований.; Однако эти способы требуют создания трансгенных мышей 4,5. Здесь, роман альтернативаМетод избыточной экспрессии sRANKL для изучения нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных описывается. В частности, minicircle (MC) ДНК-технология и гидродинамические методы доставки были использованы для достижения перенос генов из sRANKL в естественных условиях и сверхэкспрессировать мыши sRANKL системно 6.
Этот метод также дополняет другие естественных условиях моделей в остеопороза, например, гормональной модуляции остеокластов следующих овариэктомию 7 и диетического вмешательства диету с низким содержанием кальция 8. Эти модели очень полезны для изучения различных аспектов нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных, однако, они требуют хирургических процедур и может занять до нескольких месяцев, в значительной стоимости 9. Удаленными яичниками (OVX) модель грызуна является экспериментальной модели на животных, где удаление яичников приводит к дефицита эстрогенов, тем самым подражая человеческой постменопаузе остеопороза 10. Человека после менопаузы остеопороз, заболевание, при котором эстроген deficiency приводит к повышенному риску переломов костей и остеопороз поражает около восьми миллионов женщин в одних только Соединенных Штатах. Хотя OVX модель полезна для постклимактерического остеопороза предлагает ограниченные преимущества при изучении остеопороза в целом. Эстроген подавляет потерю костной массы, путем индукции остеокластов и остеобластов ингибирования апоптоза, поэтому в его отсутствие увеличился остеокластов активность наблюдается 10-12. Соотношение RANKL-ОПГ дисбаланс, который способствует резорбции кости наблюдается 13. Тем не менее, дефицит эстрогенов в естественных условиях также сопровождается снижением уровня трансформирующий фактор роста β (TGF β), увеличение интерлейкина-7 (IL-7) и TNF, IL-1 и IL-6 14,15. Поскольку эти цитокины известно костного ремоделирования функции модулирующие зависит от RANKL пути, невозможно приписать никакой активации остеокластов исключительно к оси RANKL-RANK. Модель, описанная в этой статье позволяет исследователям изучать в Львовео ось RANKL-ранг в остеокластогенеза и потери костной массы без провоспалительных цитокинов по сравнению с OVX моделях грызунов.
Кроме того, в пробирке методы остеокластогенеза являются важными инструментами для изучения активации остеокластов для потенциальных терапевтического лечения заболеваний опорно-двигательного. Предыдущие исследования также показали, что культивирование костного мозга мыши, полученные макрофагов (BMMs) с мышь макрофагов колониестимулирующего фактора (M-CSF) и мыши sRANKL может привести к остеокластов дифференциации 3,16,17. Здесь, протоколы для генерации многоядерные остеокластов-подобных клеток из костного мозга мыши, а также из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в пробирке 18 описаны. Анализы на основе клеток, необходимых для определения зрелую терминально дифференцированных и полностью функциональный остеокластов также кратко описаны. Эти методы в пробирке дополняют роман в естественных условиях подхода и вместе служить рowerful инструменты следственные учиться остеокластов дифференциации и активации. С помощью этих систем, ученые способны генерировать остеокласты ин виво и ин витро и определить стимулы и сигналы, необходимые для их пролиферации и активации, а также проверить эффективность фармакологических и биологических ингибиторов.
Protocol
Representative Results
Discussion
Опорно-двигательного аппарата, являются основными причинами заболеваемости и инвалидности и состоят из более чем 150 заболеваний и синдромов; влияя на приблизительно 90 миллионов американцев сегодня. Воспаление суставов и разрушения кости являются преобладающими особенности опорно-д?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
Materials
| alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
| Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
| Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
| Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
| Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
| Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
| Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
| Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
| MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |
References
- Yelin, E. Cost of musculoskeletal diseases: impact of work disability and functional decline. The Journal of rheumatology. Supplement. 68, 8-11 (2003).
- Boyce, B. F., Rosenberg, E., de Papp, A. E., Duong le, T. The osteoclast, bone remodelling and treatment of metabolic bone disease. European journal of clinical investigation. 42, 1332-1341 (2012).
- Lacey, D. L., et al. Osteoprotegerin ligand is a cytokine that regulates osteoclast differentiation and activation. Cell. 93, 165-176 (1998).
- Mizuno, A., et al. Transgenic mice overexpressing soluble osteoclast differentiation factor (sODF) exhibit severe osteoporosis. Journal of bone and mineral metabolism. 20, 337-344 (2002).
- Bucay, N., et al. osteoprotegerin-deficient mice develop early onset osteoporosis and arterial calcification. Gene., & development. 12, 1260-1268 (1998).
- Suda, T., Liu, D. Hydrodynamic gene delivery: its principles and applications. Molecular therapy: the journal of the American Society of Gene Therapy. 15, 2063-2069 (2007).
- Wronski, T. J., Dann, L. M., Scott, K. S., Cintron, M. Long-term effects of ovariectomy and aging on the rat skeleton. Calcified tissue international. 45, 360-366 (1989).
- Seto, H., Aoki, K., Kasugai, S., Ohya, K. Trabecular bone turnover, bone marrow cell development, and gene expression of bone matrix proteins after low calcium feeding in rats. Bone. 25, 687-695 (1999).
- Lelovas, P. P., Xanthos, T. T., Thoma, S. E., Lyritis, G. P., Dontas, I. A. The laboratory rat as an animal model for osteoporosis research. Comparative medicine. 58, 424-430 (2008).
- Sherman, B. M., West, J. H., Korenman, S. G. The menopausal transition: analysis of LH, FSH, estradiol, and progesterone concentrations during menstrual cycles of older women. The Journal of clinical endocrinology and metabolism. 42, 629-636 (1976).
- Hughes, D. E., et al. Estrogen promotes apoptosis of murine osteoclasts mediated by TGF-beta. Nature medicine. 2, 1132-1136 (1996).
- Kousteni, S., et al. Nongenotropic, sex-nonspecific signaling through the estrogen or androgen receptors: dissociation from transcriptional activity. Cell. 104, 719-730 (2001).
- Ominsky, M. S., et al. RANKL inhibition with osteoprotegerin increases bone strength by improving cortical and trabecular bone architecture in ovariectomized rats. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 23, 672-682 (2008).
- Kitazawa, R., Kimble, R. B., Vannice, J. L., Kung, V. T., Pacifici, R. Interleukin-1 receptor antagonist and tumor necrosis factor binding protein decrease osteoclast formation and bone resorption in ovariectomized mice. The Journal of clinical investigation. 94, 2397-2406 (1994).
- Weitzmann, M. N., Pacifici, R. Estrogen deficiency and bone loss: an inflammatory tale. The Journal of clinical investigation. 116, 1186-1194 (2006).
- Suda, T., Nakamura, I., Jimi, E., Takahashi, N. Regulation of osteoclast function. J Bone Miner Res. 12, 869-879 (1997).
- Asagiri, M., Takayanagi, H. The molecular understanding of osteoclast differentiation. Bone. 40, 251-264 (2007).
- Matsuzaki, K., et al. Osteoclast differentiation factor (ODF) induces osteoclast-like cell formation in human peripheral blood mononuclear cell cultures. Biochemical and biophysical research communications. 246, 199-204 (1998).
- Adamopoulos, I. E., et al. Synovial fluid macrophages are capable of osteoclast formation and resorption. The Journal of pathology. 208, 35-43 (2006).
- Adamopoulos, I. E., et al. Interleukin-17A upregulates receptor activator of NF-kappaB on osteoclast precursors. Arthritis researc., & therapy. 12, (2010).
- Jones, D., Glimcher, L. H., Aliprantis, A. O. Osteoimmunology at the nexus of arthritis, osteoporosis, cancer, and infection. J Clin Invest. 121, 2534-2542 (2011).
- Sato, K., Takayanagi, H. Osteoclasts, rheumatoid arthritis, and osteoimmunology. Curr Opin Rheumatol. 18, 419-426 (2006).
- Das, S., Crockett, J. C. Osteoporosis – a current view of pharmacological prevention and treatment. Drug design, development and therapy. 7, 435-448 (2013).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Ehrhardt, A., Kay, M. A. Minicircle DNA vectors devoid of bacterial DNA result in persistent and high-level transgene expression in vivo. Molecular therapy : the journal of the American Society of Gene Therapy. 8, 495-500 (2003).
- Kay, M. A., He, C. Y., Chen, Z. Y. A robust system for production of minicircle DNA vectors. Nature biotechnology. 28, 1287-1289 (2010).
- Chen, Z. Y., He, C. Y., Kay, M. A. Improved production and purification of minicircle DNA vector free of plasmid bacterial sequences and capable of persistent transgene expression in vivo. Human gene therapy. 16, 126-131 (2005).
- Halleen, J. M., et al. Tartrate-resistant acid phosphatase 5b: a novel serum marker of bone resorption. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 15, 1337-1345 (2000).
- Adamopoulos, I. E., et al. IL-23 is critical for induction of arthritis, osteoclast formation, and maintenance of bone mass. J Immunol. 187, 951-959 (2011).
- Suda, T., Takahashi, N., Martin, T. J. Modulation of osteoclast differentiation. Endocrine reviews. 13, 66-80 (1992).
- Takahashi, N., et al. Osteoblastic cells are involved in osteoclast formation. Endocrinology. 123, 2600-2602 (1988).
- Bradley, E. W., Oursler, M. J. Osteoclast culture and resorption assays. Methods Mol Biol. 455, 19-35 (2008).
- Arai, F., et al. Commitment and differentiation of osteoclast precursor cells by the sequential expression of c-Fms and receptor activator of nuclear factor kappaB (RANK) receptors. The Journal of experimental medicine. 190, 1741-1754 (1999).
- Fuller, K., et al. Macrophage colony-stimulating factor stimulates survival and chemotactic behavior in isolated osteoclasts. The Journal of experimental medicin. 178, 1733-1744 (1993).
- Edwards, J. R., Mundy, G. R. Advances in osteoclast biology: old findings and new insights from mouse models. Nature reviews. Rheumatology. 7, 235-243 (2011).
- Weinstein, R. S., et al. Promotion of osteoclast survival and antagonism of bisphosphonate-induced osteoclast apoptosis by glucocorticoids. The Journal of clinical investigation. 109, 1041-1048 (2002).
