Differentiation of precursor cells into osteoclasts is regulated by cytokines and growth factors. Here, a novel gene transfer technique for differentiation of osteoclasts in vivo and cell culture protocols for differentiating precursor cells into osteoclasts in vitro as a method to study the effects of cytokines on osteoclastogenesis are described.
Differentiation and activation of osteoclasts play a key role in the development of musculoskeletal diseases as these cells are primarily involved in bone resorption. Osteoclasts can be generated in vitro from monocyte/macrophage precursor cells in the presence of certain cytokines, which promote survival and differentiation. Here, both in vivo and in vitro techniques are demonstrated, which allow scientists to study different cytokine contributions towards osteoclast differentiation, signaling, and activation. The minicircle DNA delivery gene transfer system provides an alternative method to establish an osteoporosis-related model is particularly useful to study the efficacy of various pharmacological inhibitors in vivo. Similarly, in vitro culturing protocols for producing osteoclasts from human precursor cells in the presence of specific cytokines enables scientists to study osteoclastogenesis in human cells for translational applications. Combined, these techniques have the potential to accelerate drug discovery efforts for osteoclast-specific targeted therapeutics, which may benefit millions of osteoporosis and arthritis patients worldwide.
Заболевания опорно-двигательного затрагивают миллионы людей в Соединенных Штатах и нынешних тяжелых последствий для национальных и местных систем здравоохранения 1. Эти расстройства характеризуются потерей костной и функции суставов, которые требуют серьезного лечения и длительные периоды восстановления. Как правило, относительное увеличение числа и / или активности остеокластов, клеток, специализирующихся на резорбируют кости, при остеопорозе и артрит наблюдается 2. В физиологических условиях количество и активность остеокластов регулируется рецептора активатора ядерного фактора κ-B лиганда (RANKL), который получают путем остеобластов. Остеопротегерин (ОПГ), рецептор приманка для RANKL также производится остеобластов 3 IN VIVO модели на животных, которые включают системную сверхэкспрессию sRANKL, или удаление ОПГ очень ценны в остеопороза исследований.; Однако эти способы требуют создания трансгенных мышей 4,5. Здесь, роман альтернативаМетод избыточной экспрессии sRANKL для изучения нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных описывается. В частности, minicircle (MC) ДНК-технология и гидродинамические методы доставки были использованы для достижения перенос генов из sRANKL в естественных условиях и сверхэкспрессировать мыши sRANKL системно 6.
Этот метод также дополняет другие естественных условиях моделей в остеопороза, например, гормональной модуляции остеокластов следующих овариэктомию 7 и диетического вмешательства диету с низким содержанием кальция 8. Эти модели очень полезны для изучения различных аспектов нарушений опорно-двигательного аппарата, связанных, однако, они требуют хирургических процедур и может занять до нескольких месяцев, в значительной стоимости 9. Удаленными яичниками (OVX) модель грызуна является экспериментальной модели на животных, где удаление яичников приводит к дефицита эстрогенов, тем самым подражая человеческой постменопаузе остеопороза 10. Человека после менопаузы остеопороз, заболевание, при котором эстроген deficiency приводит к повышенному риску переломов костей и остеопороз поражает около восьми миллионов женщин в одних только Соединенных Штатах. Хотя OVX модель полезна для постклимактерического остеопороза предлагает ограниченные преимущества при изучении остеопороза в целом. Эстроген подавляет потерю костной массы, путем индукции остеокластов и остеобластов ингибирования апоптоза, поэтому в его отсутствие увеличился остеокластов активность наблюдается 10-12. Соотношение RANKL-ОПГ дисбаланс, который способствует резорбции кости наблюдается 13. Тем не менее, дефицит эстрогенов в естественных условиях также сопровождается снижением уровня трансформирующий фактор роста β (TGF β), увеличение интерлейкина-7 (IL-7) и TNF, IL-1 и IL-6 14,15. Поскольку эти цитокины известно костного ремоделирования функции модулирующие зависит от RANKL пути, невозможно приписать никакой активации остеокластов исключительно к оси RANKL-RANK. Модель, описанная в этой статье позволяет исследователям изучать в Львовео ось RANKL-ранг в остеокластогенеза и потери костной массы без провоспалительных цитокинов по сравнению с OVX моделях грызунов.
Кроме того, в пробирке методы остеокластогенеза являются важными инструментами для изучения активации остеокластов для потенциальных терапевтического лечения заболеваний опорно-двигательного. Предыдущие исследования также показали, что культивирование костного мозга мыши, полученные макрофагов (BMMs) с мышь макрофагов колониестимулирующего фактора (M-CSF) и мыши sRANKL может привести к остеокластов дифференциации 3,16,17. Здесь, протоколы для генерации многоядерные остеокластов-подобных клеток из костного мозга мыши, а также из человеческих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) в пробирке 18 описаны. Анализы на основе клеток, необходимых для определения зрелую терминально дифференцированных и полностью функциональный остеокластов также кратко описаны. Эти методы в пробирке дополняют роман в естественных условиях подхода и вместе служить рowerful инструменты следственные учиться остеокластов дифференциации и активации. С помощью этих систем, ученые способны генерировать остеокласты ин виво и ин витро и определить стимулы и сигналы, необходимые для их пролиферации и активации, а также проверить эффективность фармакологических и биологических ингибиторов.
Опорно-двигательного аппарата, являются основными причинами заболеваемости и инвалидности и состоят из более чем 150 заболеваний и синдромов; влияя на приблизительно 90 миллионов американцев сегодня. Воспаление суставов и разрушения кости являются преобладающими особенности опорно-д?…
The authors have nothing to disclose.
Research was partly supported by NIH research grants R01 AR062173 and SHC 250862 to IEA. ES is the recipient of NIH T32 CTSC predoctoral fellowship.
alpha-MEM | Life Technologies | 12561-056 | |
Human M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-096-492 | |
Mouse M-CSF | Miltenyi Biotec | 130-094-643 | |
Human RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-631 | |
Mouse RANK-Ligand – soluble | Miltenyi Biotec | 130-094-076 | |
Tailveiner Restrainer for mice | Braintree | TV-150 STD | |
Mouse TRANCE/RANK L/TNFSF11 Quantikine ELISA Kit | R&D systems | MTR00 | |
Acid Phosphatase, Leukocyte (TRAP) Kit | Sigma | 387A | |
MouseTRAP assay | immunodiagnostic systems | SB-TR103 |