Introduction
Streptococcus pneumoniae, קולוניאלי משותפת של קהילת polymicrobial של לוע האף, הוא מסוגל להתחרות עם pneumococci אחר ומינים קרובים באמצעות הייצור של פפטידים מיקרוביאלית מיוצרים bacterially (bacteriocins). כל זן דלקת ריאות באופן מלא רצף שנבחן עד היום מכיל גרסה של מוקד acteriocin- ב אייק l eptide עמ ', BLP. ייצור Bacteriocin ידי pneumococcus הודגם להיות חשוב בתוצאות הן במבחנה בתחרות vivo 1-4. דינמיקה תחרותית מושפעת מהביטוי של bacteriocins המגוון יחד עם חלבוני חסינותו מקור בתגובה לפרומון פפטיד ספציפי. אינדוקציה של מוקד BLP נשלטת על ידי מערכת חישת מניין שבו פרומון פפטיד, BlpC, נקשר לקינאז החיישן, BlpH, ויוזם מפל איתות וכתוצאה מכךשעתוק של 5,6 מוקד BLP. ישנם ארבע וריאציות allelic של BlpC שכל נקשרים לBlpH המקור שלה 6. לתא כדי לשרוד את ההשפעות של bacteriocin משלו, הגנים המקודדים את חלבוני חסינותו מקור מתועתקים באותו אופרון ככל אחד מהגנים bacteriocin. הרג מתרחש אם זן מתחרה הוא לא מסוגל upregulate מוקד BLP בתגובה לפרומון אקסוגניים או, אם הזן חסר את גן החסינות הספציפי הנדרש להגנה. המורכב טרנספורטר, BlpAB נדרש להפרשה והעיבוד של פרומון פפטיד ופפטידים bacteriocin 2,4. לאחרונה, הוכח שחלק משמעותי מזני דלקת ריאות הם "רמאים", כלומר יש להם מוטציה שמורה בגן blpA אשר הופך אותם מסוגל להפריש פרומונים וbacteriocins 1,2. זנים אלה מסוגלים להגיב לBlpC אקסוגניים 2 מופרש על ידי צהלהזנים משעממים המאפשרים הייצור של חלבוני חסינות.
אמנם, הכנות גולמי של bacteriocins מsupernatants ניתן להכין מזני מפיק באמצעות צעדי שיטות ביוכימיות להשגת טוהר, גישה זו אינה שימושית לסינון אוסף גדולה של בידודים ואם רמת ביטוי bacteriocin היא נמוכה בתרבויות מרק גדל 2,7- 9. Assay הכיסוי משמש כדרך מהירה כדי לחקור את הדינמיקה התחרותית בין זנים שעלולים להתקיים במבחנה. לשם כך, מתח דלקת ריאות הוא על צלחת אגר ואפשרו לגדול כדי להשיג ריכוזי חיידקים מקומיים מספיקים לאינדוקציה של מוקד BLP-מחוסן מראש. זן שני הוא מחוסן אז לפתרון אגר רך מותך אשר לאחר מכן מיושם על זן מחוסן מראש לבדיקת רגישות. כדי להעריך את הפעילות של מוקד BLP (עצמאית של פעילות מעכבת), יכולים להיות מעולף זנים בסדרה של הרי זני כתב BlpC שתוארו קודם לכן. זנים אלו נבנו כדי להכיל אחד משלושה אללים blpH שונים שמגיבים לשלושה פרומונים BlpC הנפוצים ביותר מופרשים על ידי pneumococci. יש לי זני כתב גן lacZ משולב שנמצא תחת השליטה של אמרגן תלוי BlpH ולבצע מחיקה בגן blpC המונע גירוי עצמי 10,11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
.1 הכנת הזנים מפיק
- Streak זן דלקת ריאות להיבדק לייצור bacteriocin על 5% צלחת אגר סויה tryptic דם כבשים ממניות מקפיא -80 מעלות צלזיוס.
הערה: השימוש בצלחות דם לצמיחה ראשונית של הזן להיבדק לעיכוב מגדיל מאוד את שחזור של assay. בנוסף, זנים שאינן דלקת ריאות אחרות המייצרים bacteriocins ניתן להשתמש למרות שתנאי גידול, ייתכן שיצטרכו להיות שונה לאורגניזם ספציפי. יש לנו להשתמש mitis Streptococcus וקטיס Lactococcus בassay הכיסוי בהצלחה. - דגירה את הצלחת למשך הלילה (O / N) על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2.
- לאחר הדגירה של זן המפיק, להכין הצלחת אגר סויה tryptic (TSA) על ידי pipetting 3,000 4,000 יחידות של קטלאז על צלחות המכילות 25 מ"ל של TSA ולהפיץ את פתרון קטלאז באמצעות חרוזים זכוכית סטרילית. בואו יבש הצלחת במשך כ10 דקות תחתארון בטיחות ביולוגי.
- לאסוף כמות נראית לעין של חיידקים על קצה פיפטה. לדקור את קצה פיפטה לתוך צלחת TSA המיובש.
הערה: יותר מ מתח מפיק אחד יכולה להיות נדקרת לתוך צלחת TSA יחידה. חשוב חלל את הדקירות, כך שהילות וכתוצאה מכך אינן חופפות.- במידת האפשר, כולל ידוע bacteriocin מפיק כביקורת חיובית ולהתאמץ כדי לשמש בשכבה כביקורת שלילית.
הערה: בקרות חיוביות ושליליות הן כבר פורסמו בעבר, והם זמינים לפי בקשה 10.
- במידת האפשר, כולל ידוע bacteriocin מפיק כביקורת חיובית ולהתאמץ כדי לשמש בשכבה כביקורת שלילית.
- דגירה צלחת TSA מכיל דקירות מרובות על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO 2 למשך 6 שעות.
2 מניות גליצרול ביצוע של הזנים הכיסוי
- הכן מניות גליצרול (תרבויות גדלו שלב אמצע מעריכי ואז מאוחסנות ב-80 מעלות צלזיוס לאחר התוספת של גליצרול) לפני היום של assay הכיסוי. לחסן 5-10 מושבות של str דלקת הריאותעין להיבדק לרגישות או הפרשת פרומון במדיום טוד יואיט עם שמרי 0.5% תמצית (THY).
הערה: בנייה של כתבים מושרה BlpC כבר תוארה בעבר 2 וזנים זמינים לפי בקשה. - דגירה 5-10 מושבות בצינורות זכוכית עם 5 מ"ל של THY עם מכסים סגורים היטב באמבט מים 37 מעלות צלזיוס בלי לרעוד.
- דגירה תרבויות על 37 מעלות צלזיוס עד שהם מגיעים OD 620 של 0.3-0.5.
הערה: זה ייקח כ 4-5 שעות בהתאם לזן המשמש.- בעדינות להפוך את הצינור כמה פעמים לפני מדידת OD.
- אם הניסוי לא ניתן לבצע באותו היום או הזן ישמש פעמים רבות בעתיד, להפוך את מניות גליצרול ולחדש את הניסוי במועד מאוחר יותר. עבור מניות גליצרול, להוסיף גליצרול לתרבויות לריכוז סופי של 20%. תרבויות Aliquot לתוך צינורות 1.5 מ"ל microcentrifuge ולאחסן ב -80 מעלות צלזיוס. הערה: דוגמאות יכולות להיות שלהנמצאת בבמשך חודשים ב-80 מעלות צלזיוס. אם לא עושה מניות גליצרול, להשתמש דגימות ישירות לassay כיסוי.
3 הכיסוי Assay
- רק לפני כיסוי יישום, לערבב את מרכיבי הכיסוי. בצינור חרוטי 15 מ"ל, להוסיף 5 מ"ל שלך, 3,000-4,000 U של קטלאז, ו200 μl של תרבות מרק מתח כיסוי שגם גדלה באותו יום או מניית גליצרול של התרבות שהיה מופשר בטמפרטורת חדר. אם אתם משתמשים בזן הכתב, להוסיף 50 μl של X-gal (40 מ"ג / מ"ל) לתערובת הכיסוי. השתמש בצינור חרוטי אחד לכל צלחת.
- לאזן תערובת כיסוי בטמפרטורת חדר לפני תוספת של TSA המותך.
- הסר את צלחת TSA עם מתח נדקר מחממה. ממסים TSA המוצק במיקרוגל ולשמור על 55 ° C אמבט מים עד מוכן לשימוש. הוסף 3 מ"ל של TSA המותך עם אגר 1.5% מקורר 55 ° C כדי כיסוי תערובת.
- מכין את תערובת הכיסוי מייד לפני pipetting, התערובת תתחיל לחזק מאודבמהירות. הערה: אם השכבה מתחילה לבסס לפני הציפוי, התוצאות תהיה uninterpretable.
- מערבבים את תערובת הכיסוי על ידי pipetting מעלה ומטה מספר פעמים עם 5 מ"ל pipet נזהר שלא להכניס בועות לתוך התערובת. לאט לאט פיפטה תערובת כיסוי ישירות על צלחת TSA נדקרה. שמור את הצלחת על המעבדתיים למאפשרות אגר להקשיח כמה דקות.
- אל תסובב את הצלחת כדי לפזר את תערובת הכיסוי, זה ימשוך צמיחה מהתרבות נדקרה לכיסוי.
- בזהירות להניח צלחת TSA עם כיסוי ל37 חממת ° C המכילה 5% CO 2 O / N (כ 16-18 לשעה).
- שים לב ללוחות לאחר צמיחת הלילה. הצלחות צריכה להראות אטום מצמיחה של זן הכיסוי למעט באזורים שבם איתות עיכוב או פרומון התרחשה. אלה יופיעו כאזורי או ברורים או כחולים סביב המתח נדקר, בהתאמה.
שים לב: למרות measurements של הקוטר של קרחת יער כחול או יכול להיות שנקבע להערכה כמותית, הבדלים בקוטר יכולים גם משתנים בהתאם לכמות חיידקים שנדקרה לתוך הצלחת. Assay הכיסוי הוא assay איכותי, כל הערכה כמותית יש לפרש בזהירות. כל סליקה גלויה בהשוואה לביקורת השלילית נחשבת כפעילות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ישנן שתי תוצאות אפשריות בassay הכיסוי. זה צריך להיות אפשרי לראות צמיחה של הזן נדקר לאחר דגירה הלילה. באיור 1 א, מתח הכיסוי רגיש לbacteriocins שיופקו. אזור של פינוי יכול להיות דמיין המקיף את המתח נדקר. בנוסף, מתערבל של המתח נדקר לתוך תערובת הכיסוי אפשרי ושניתן לראות באיור 1 א. באיור 1 ב, מתח הכיסוי אינו חסין מפני bacteriocins שמופרש כאמור על ידי היעדר הילה המקיפה את הדקירה. אפשר גם שהמתח נדקר לא מפריש bacteriocins. עבור assay האיתות, שתי תוצאות שונות אפשריות. הזן נדקר הוא מסוגל להפריש פרומון שמקיים אינטראקציה עם kinase היסטידין של זן הכיסוי, כפי שניתן לראות דרך ההתמוטטות של X-gal, כפי שמוצג באיור 2 א. אם פרומון אינו מפעיל שעתוק של מוקד BLP בזן הכתב, או אם המתח דקר אינו מפריש פרומון, הפירוט של X-gal לא יתרחש כפי שמוצג באיור 2.
איור 1 מראה עיכוב BLP תיווך והחסינות בassay כיסוי. () P133 הזנים, מפיק bacteriocin היה ממוסמר לצלחת TSA ואיפשר לגדול במשך 6 שעות. P250 מתח, מתח bacteriocin שלילי, היה מחוסן לתוך הכיסוי. צלחות צולמו לאחר O / דגירה N. אזור של פינוי מצויינים על ידי החץ. P133 הזנים (ב ') היה ממוסמר לצלחת TSA וטופחו במשך 6 שעות. זן 130, המכיל מוטציה frameshift בblpA, היה מחוסן לתוך הכיסוי. לאחר O דגירה / N, צלחות צולמו.
page = "תמיד"> 
פרומון .2 איור תיווך הפעלה של מוקד BLP באיתות assay. () P133 הזנים, secretor R6 סוג BlpC, היה ממוסמר לצלחת TSA וטופחו במשך 6 שעות. P981 מתח, כתב R6 סוג BlpC עם מחיקה בBlpC, היה מחוסן לתוך הכיסוי. תמונות צולמו לאחר הדגירה O / N. (B) P133 היה ממוסמר לצלחת TSA. לאחר הדגירה של 6 שעות, P845, כתב P164 סוג BlpC עם מחיקה בBlpC, היה מחוסן לתוך הכיסוי. תמונות צולמו לאחר O / N צמיחה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
assay הכיסוי זוהי דרך מהירה כדי לקבוע את הטווח של פעילות עבור יצרני bacteriocin ולהפגין אינטראקציות תחרותיות שעלולות להתרחש בין זני דלקת ריאות. Assay הכיסוי יכול להיות מותאם לשימוש עבור הקרנת זנים מרובים לייצור bacteriocin על צלחת אחת. יש לנו הוקרנו בהצלחה אוספי מתח גדולים עם assay זה על ידי שימוש במשכפל 48 פינים לחסן צלחות SBA ממחצית מצלחת 96 היטב. לאחר דגירה הלילה, צמיחה מועברת לצלחת TSA באמצעות המשכפל ופירסינג המשטח אגר של הצלחת עם הסיכות של המשכפל.
פפטידים מיקרוביאלית מופרשים bacterially אחרים שמוסדרים באופן תלוי בצפיפות כמו lantibiotics גם ניתן לבחון באמצעות טכניקת הכיסוי 7,12,13. האפשרות זו שימושית במיוחד כאשר טיהור bacteriocin או lantibiotic קשה. למרות שניתן לבדוק supernatants למיקרוביאליתפעילות, הביטוי של bacteriocins BLP נגזר במרק הוא מאוד מוגבל או לא קיים (מידע לא מוצג). Assay הכיסוי מאפשר לצמיחה לצפיפות גבוהה יותר אשר אינה מושגת כאשר אורגניזמים גדלים בנוזל. צמיחה במדיום מוצק עשויה גם לשקף באופן הדוק יותר את תנאי גידול in vivo של לוע האף.
גם assay הכיסוי ניתן להשתמש כדי לבחון את היכולת של הזן נדקר למפרישה פרומון איתות הספציפי bacteriocin. זה דורש בנייה של מתח כתב המבטא את חלבון קולטן פרומון ושבו אמרגן מגיב פרומון ממוקם במעלה הזרם של גן lacZ. ההערכה של הפרשת פרומון על ידי זן נדקר שימושית במיוחד כקריאה של פעילות מוקד BLP אם המתח נדקר לא לעכב את מתח הכיסוי. חוסר היכולת לעכב את מתח הכיסוי יכולה להיות התוצאה של מוקד BLP שאינו פונקציונלי (כגון בלהתאמץ עם מוטציה טרנספורטר) או בגלל bacteriocins המופרש אינו פעיל נגד זן כיסוי המסוים שנבדק. כיסוי זן הכתב מספק מידע נוסף שהמוקד במפיק יש טרנספורטר מתפקד במלואה שתי מערכת הרכיב וBlpA מאפשר לגברת ביטוי והפרשה של פרומון. משמעות הדבר הוא כי כל bacteriocins מקודד גם מופרש.
ישנן מספר מגבלות לassay זה. Assay הכיסוי הוא assay איכותי, כך השוואות בין הפעילות המעכבת או הפרשת פרומון של זנים שונים צריכים להיעשות בזהירות. שיעורי צמיחה ותנאים יש לשקול בעת השוואת זנים שונים, כי התוצאה של assay מסתמכת במידה רבה על שיעור הצמיחה של השכבה וזנים נדקרו. התוספת של קטלאז הן לצלחת ואת השכבה חשובה על מנת להסיר את ההשפעות המעכבות של H 2 O 2 דלקת ריאות ייצור על, צמיחה של זן הכיסוי כאשר בפרט באמצעות אורגניזם שלילי קטלאז בשכבה. בהתחשב במגוון הידוע של תוכן גנומי באוכלוסיית דלקת הריאות, כל פעילות מעכבת ראתה עם assay זה לא ניתן לייחס באופן אוטומטי למוקד BLP ללא ניתוח deletional.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Trypticase Soy Agar with 5% Sheep Blood | Fisher | B21261X | For growth from freezer cultures |
| Catalase | Sigma | C100-500mg | 4,741 Units per plate |
| Todd Hewitt Broth + Yeast Extract (THY) | Fisher | DF0492-17-6 | 30 g of THB, 5 g yeast extract, 1 L ddH2O autoclave |
| Trypticase Soy Broth + Agar plates (TSA) | Fisher | B11768 | 30 g of TS, 15 g agar, 1 L ddH2O autoclave |
| 5-bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside (X-gal) | Sigma | B4252-50MG | Dissolve in dimethylformamide |
| Petri dishes | Fisher | FB0875712 | |
| Spectrophometer | Measures the OD620 of cultures | ||
| 37 °C water bath | |||
| 37 °C incubator with 5% CO2 | |||
| 15 ml conical tube |
References
- Dawid, S., Roche, A. M., Weiser, J. N. The blp bacteriocins of Streptococcus pneumoniae mediate intraspecies competition both in vitro and in vivo. Infect Immun. 75 (1), 443-451 (2007).
- Sawa, N., et al. Isolation and characterization of enterocin W, a novel two-peptide lantibiotic produced by Enterococcus faecalis NKR-4-1. Appl Environ Microbiol. 78 (3), 900-903 (2012).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195 (7), 1561-1572 (2013).
- Lux, T., Nuhn, M., Hakenbeck, R., Reichmann, P. Diversity of bacteriocins and activity spectrum in Streptococcus pneumoniae. J Bacteriol. 189 (21), 7741-7751 (2007).
- Reichmann, P., Hakenbeck, R. Allelic variation in a peptide-inducible two-component system of Streptococcus pneumoniae. FEMS Microbiol Lett. 190 (2), 231-236 (2000).
- Saizieu, A., et al. Microarray-based identification of a novel Streptococcus pneumoniae regulon controlled by an autoinduced peptide. J Bacteriol. 182 (17), 4696-4703 (2000).
- Barbour, A., Philip, K., Muniandy, S. Enhanced production, purification, characterization and mechanism of action of salivaricin 9 lantibiotic produced by Streptococcus salivarius NU10. PLoS One. 8 (10), 77751 (2013).
- Wladyka, B., et al. Isolation, biochemical characterization, and cloning of a bacteriocin from the poultry-associated Staphylococcus aureus strain CH-91. Appl Microbiol Biotechnol. 97 (16), 7229-7239 (2013).
- Shea, E. F., et al. Bactofencin a, a new type of cationic bacteriocin with unusual immunity. 4 (6), 00498-00413 (2013).
- Son, M. R., et al. Conserved mutations in the pneumococcal bacteriocin transporter gene, blpA, result in a complex population consisting of producers and cheaters. MBio. 2 (5), (2011).
- Kochan, T. J., Dawid, S. The HtrA protease of Streptococcus pneumoniae controls density-dependent stimulation of the bacteriocin blp locus via disruption of pheromone secretion. J Bacteriol. 195, 1561-1572 (2013).
- Widdick, D. A., et al. Cloning and engineering of the cinnamycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces cinnamoneus cinnamoneus DSM 40005. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (7), 4316-4321 (2003).
- Begley, M., Cotter, P. D., Hill, C., Ross, R. P. Identification of a novel two-peptide lantibiotic, lichenicidin, following rational genome mining for LanM proteins. Appl Environ Microbiol. 75 (17), 5451-5460 (2009).
