単離されたミトコンドリアのフローサイトメトリーによる外膜タンパク質の免疫検出
Summary
ここで説明するフローサイトメトリーによりげっ歯類組織分析から単離されたミトコンドリアの免疫標識によってミトコンドリア外膜タンパク質を検出および定量するための方法である。この方法は、ミトコンドリア亜集団の機能的側面を評価するために拡張することができる。
Abstract
動物組織内のミトコンドリア外膜タンパク質成分を検出し、監視するための方法は、ミトコンドリアの生理学および病態生理学を研究するために不可欠である。このプロトコルは、齧歯類の組織から単離されたミトコンドリアは、免疫標識およびフローサイトメトリーによって分析する技術が記載されている。ミトコンドリアは、齧歯類脊髄から単離され、ミエリン、神経組織から調製されたミトコンドリア画分の主要な汚染物質を除去するために急速な濃縮工程に供される。単離されたミトコンドリアは、その後、選択した抗体と、蛍光結合二次抗体で標識する。フローサイトメトリーによる分析は、免疫標識タンパク質の検出および定量に続いて、ミトコンドリア特異的色素で染色することにより、ミトコンドリア調製物の相対的な純度を検証します。この技術は、サンプルあたりのミトコンドリアの数十万の分析を可能にする、迅速な定量化及びハイスループットである。それは、新規なpを評価するために適用され正常な生理的条件下で、ミトコンドリアの表面でroteinsだけでなく、病理中にこの細胞小器官にmislocalizedなる可能性がタンパク質。重要なことに、この方法は、ミトコンドリア亜集団の特定の活動を報告する蛍光指示薬色素に結合され、中枢神経系（脳および脊髄）、ならびに肝臓からミトコンドリアに対して実行可能であることができる。
Introduction
ミトコンドリアは、高エネルギー需要部位に輸送され、生理的刺激1に迅速に対応している、核分裂と核融合の複数のラウンドを受ける非常にダイナミックな細胞小器官である。それはますます異なる組織内のミトコンドリア、さらには異なる細胞区画には、異なる機能プロファイルを有することが認識されているので、新しい方法は、これらの異なるミトコンドリアのサブセットを識別するために必要とされる。
顕微鏡検査は、個別のミトコンドリアを視覚化することができ、ミトコンドリアでのまたは中のタンパク質の存在が免疫蛍光2によって決定することができる手段を提供する。しかしながら、この方法による定量分析は、労働集約的であり、不死化または初代細胞株を用いた実験に適している。組織に由来する個別のミトコンドリアの研究が著しく困難であり、ほとんどの方法はevaluと同時にミトコンドリアのサブセットを容易に識別を可能にしないミトコンドリア機能3のation。
このハードルに対処するために、ミトコンドリアげっ歯類組織から単離し、続いてフローサイトメトリーにより分析を免疫標識するための新規な方法が開発されている。これは、顕微鏡による分析に比べてミトコンドリア外膜に局在するタンパク質の迅速な検出および定量を可能にする、はるかに少ない労働集約的であり、単一のサンプル中のミトコンドリアの数千の分析を可能にする。このアッセイは、ミトコンドリアにおいて構成的に存在すると考えられているミトコンドリア外膜タンパク質の運命および相対量を監視するために適用することができ、ミトコンドリアの表面へのタンパク質の補充、または病理学的状態におけるミトコンドリアにmislocalizedタンパク質の検出。また、従来の蛍光指示色素の取り込みは、異なるミトコンドリアにおけるミトコンドリア機能の特定の側面の同時評価を可能にする亜集団。
Protocol
Representative Results
Discussion
これは、ミトコンドリアが正常な生理と病気の両方で重要なプレーヤーであることがますます明らかである。免疫ブロッティングながら全人口の平均で、この方法のレポートは、特定の条件でミトコンドリア内またはミトコンドリア表面で見出されるタンパク質を決定することができます。この方法は、ミトコンドリアの亜集団またはサブセットの相対存在量についての情報を得ることはで?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、フローサイトメーターにアクセスするためのローリー·Destroismaisonsと卓越した技術サポートのためのサラPeyrardとDr.Alexandreプラットに感謝します。また、調製物からのミエリンの除去に関する彼の貢献のために博士ティモシー·ミラーを承認したいと思います。この作品は、ヘルスリサーチ（CIHR）神経筋研究パートナーシップ、革新のためのカナダの財団、カナダのALS協会、ALS研究フリック財団、CHUM財団とフォン·ド·ラ·ルシェルシュエンサンテ·デュ·ケベック（CVV）のカナダの研究所によってサポートされていました。 CVVおよびNAの両方がフォン·ド·ラ·ルシェルシュエンサンテ·デュ·ケベック州とCIHR新しい研究者の研究学者である。 SPはカナダのALS協会からティム·ノエル学生の身分によってサポートされています。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
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