Иммунологический из белков наружной мембраны с помощью проточной цитометрии из изолированных митохондрий
Summary
Описанный здесь метод для обнаружения и количественной оценки митохондриальных белков наружной мембраны путем иммунного митохондрий, выделенных из ткани грызунов и анализа с помощью проточной цитометрии. Этот метод может быть расширен, чтобы оценить функциональные аспекты митохондриальных субпопуляций.
Abstract
Методы для обнаружения и мониторинга митохондриальные внешние компоненты мембранного белка в животных тканях являются жизненно важными для изучения митохондриальной физиологии и патофизиологии. Этот протокол описывает способ, где митохондрии, выделенные из ткани грызунов immunolabeled и анализировали с помощью проточной цитометрии. Митохондрии изолированы от грызунов спинного мозга и подвергали быстрому обогащению этапе с тем, чтобы удалить миелина, важную примеси митохондриальных фракций, полученных из нервной ткани. Изолированные митохондрии затем метили антителом выбора и флуоресцентно конъюгированного второго антитела. Анализ с помощью проточной цитометрии проверяет относительную чистоту митохондриальных препаратов путем окрашивания с митохондриальной специфической краски, а затем обнаружения и количественного определения immunolabeled белка. Эта техника является быстрое, количественной оценке и высокой пропускной, позволяя для анализа сотен тысяч митохондрий на образец. Он применим для оценки нового рroteins в митохондриальной поверхности при нормальных физиологических условиях, а также белки, которые могут стать mislocalized к этому органеллы во патологии. Важно отметить, что этот метод может быть соединен с флуоресцентными красителями индикаторов сообщить о некоторых видах деятельности митохондриальных групп населения и является допустимым для митохондрий из центральной нервной системы (головного и спинного мозга), а также печени.
Introduction
Митохондрии являются высокая динамика органеллы, которые подвергаются несколько раундов деления и синтеза, транспортируются к местам высокой потребности в энергии и быстро реагировать на физиологические стимулы 1. Так как это все чаще признается, что митохондрии в различных тканях, даже различные сотовой отсеков, имеют различные функциональные профили, новые методы необходимы для выявления этих различных митохондриальных подмножества.
Микроскопии обеспечивает средства, посредством которых отдельные митохондрии могут быть визуализированы и присутствие белка в митохондрии или в можно определить с помощью иммунофлюоресценции 2. Тем не менее, количественный анализ с помощью этого метода является трудоемким и больше подходит для экспериментов с использованием иммортализованные или первичные клеточные линии. Изучение индивидуального митохондрий, полученной из ткани значительно труднее, и большинство методы не позволяют легко идентифицировать митохондриальных подмножеств одновременно с evaluвания митохондриальной функции 3.
Для решения этого препятствия, новый метод immunolabel митохондрии, выделенные из грызунов тканей и затем анализируют с помощью проточной цитометрии была разработана. Это позволяет для быстрого обнаружения и определения количества белков, локализованных в митохондриальной наружной мембраны, который по сравнению с анализом микроскопией, гораздо менее трудоемким и позволяет анализ тысяч митохондрий в одном образце. Этот анализ может быть применен для контроля за судьбу и относительное количество митохондриальных белков наружной мембраны, что, как считается, конститутивно присутствует в митохондриях, набор белков в митохондриальной поверхности, или обнаружение белков mislocalized в митохондрии в патологических условиях. Кроме того, включение обычных флуоресцентных красителей показатель позволяет одновременно оценку некоторых аспектов функции митохондрий в разных митохондриальныхсубпопуляции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Становится все более очевидным, что митохондрии являются ключевыми игроками в обоих нормальной физиологии и болезней. В то время как иммуноблотинг может определить, какие белки были найдены в митохондриях или в митохондриальной поверхности в определенном состоянии, этот метод отчеты…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Лори Destroismaisons и Сара Пейрар за выдающиеся технической поддержки и Dr.Alexandre Prat для доступа к проточной цитометрии. Мы также хотели бы выразить признательность доктору Тимоти Миллера за его вклад относительно изъятия миелина от препаратов. Эта работа была поддержана Канадским институтом исследований (CIHR) нервно-мышечной исследовательского партнерства в области здравоохранения, Канадский фонд инноваций, ALS общества Канады, Фрик фонда ALS исследований, CHUM фонда и Fonds-де-ла Recherche ан Санте Квебека (CVV). Оба CVV и NA являются исследования ученых из Fonds-де-ла Recherche ан Здоровье Квебека и CIHR Новые Следователи. SP поддерживается Тим Ноэль студенчества от ALS общества Канады.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H. Mitochondrial dynamics in neurodegeneration. Trends Cell Biol. 23, 64-71 (2013).
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H., Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
