Immunolocalizzazione della membrana esterna proteine mediante citometria di flusso di mitocondri isolati
Summary
Qui descritto è un metodo per rilevare e quantificare proteine di membrana mitocondriale esterna da immunomarcatura di mitocondri isolati da tessuto roditore e l'analisi mediante citometria a flusso. Questo metodo può essere esteso a valutare aspetti funzionali di sottopopolazioni mitocondriali.
Abstract
Metodi per rilevare e monitorare mitocondriali componenti proteiche della membrana esterna nei tessuti animali sono di vitale importanza per lo studio della fisiologia mitocondriale e fisiopatologia. Questo protocollo descrive una tecnica in cui i mitocondri isolati da tessuto roditori sono immunolabeled e analizzati mediante citometria a flusso. I mitocondri sono isolate dal midollo spinale di roditori e sottoposti ad una fase di arricchimento rapido in modo da rimuovere mielina, un importante contaminante di frazioni mitocondriali preparate da tessuto nervoso. Mitocondri isolati vengono poi etichettati con un anticorpo di scelta e di un anticorpo secondario coniugato fluorescente. L'analisi per flusso citometria verifica la relativa purezza delle preparazioni mitocondriali da colorazione con un colorante specifico mitocondriale, seguita da rilevamento e la quantificazione di proteine immunolabeled. Questa tecnica è rapido, quantificabile e ad alta velocità, consentendo l'analisi di centinaia di migliaia di mitocondri per campione. È applicabile per valutare romanzo proteins sulla superficie mitocondriale in condizioni fisiologiche normali, così come le proteine che possono diventare mislocalized a questo organello durante patologia. È importante sottolineare che questo metodo può essere accoppiato a coloranti indicatori fluorescenti a riferire su determinate attività di sottopopolazioni mitocondriali ed è fattibile per i mitocondri del sistema nervoso centrale (cervello e midollo spinale), così come il fegato.
Introduction
I mitocondri sono organelli altamente dinamiche che subiscono vari cicli di fissione e fusione, sono trasportati ai siti di domanda di alta energia e di rispondere rapidamente agli stimoli fisiologici 1. Poiché è sempre più riconosciuto che i mitocondri all'interno di diversi tessuti, anche diversi compartimenti cellulari, hanno profili funzionali distinti, nuovi metodi sono necessari per identificare questi sottoinsiemi mitocondriali distinti.
Microscopia fornisce un mezzo attraverso il quale i singoli mitocondri possono essere visualizzati e la presenza di una proteina in o nei mitocondri può essere determinato mediante immunofluorescenza 2. Tuttavia, l'analisi quantitativa con questo metodo è laborioso ed è più adatto per gli esperimenti che utilizzano linee cellulari immortalizzate o primari. Lo studio dei mitocondri individuale derivate da tessuti è molto più difficile e la maggior parte dei metodi non consentono una facile identificazione di sottoinsiemi mitocondriali in concomitanza con la valuzione della funzione mitocondriale 3.
Per far fronte a questo ostacolo, un nuovo metodo per immunolabel mitocondri isolati da tessuti di roditori e successivamente analizzati mediante citometria a flusso è stato sviluppato. Questo permette la rapida individuazione e la quantificazione delle proteine localizzate alla membrana esterna mitocondriale, che rispetto all'analisi al microscopio, è molto meno laborioso e permette l'analisi di migliaia di mitocondri in un singolo campione. Questo test può essere applicato per controllare il destino e la quantità relativa di proteine di membrana esterna mitocondriale che si pensa siano costitutivamente presente alla mitocondri, l'assunzione di proteine alla superficie mitocondriale, o la rilevazione di proteine mislocalized ai mitocondri in condizioni patologiche. Inoltre, l'incorporazione di coloranti convenzionali indicatori fluorescenti consente la valutazione simultanea di alcuni aspetti della funzione mitocondriale in mitocondriale distintosottopopolazioni.
Protocol
Representative Results
Discussion
E 'sempre più evidente che i mitocondri sono i principali attori sia normale fisiologia e patologia. Mentre immunoblotting può determinare quali proteine si trovano all'interno dei mitocondri né sulla superficie mitocondriale in una certa condizione, questo metodo relazioni sulla media dell'intera popolazione. Questo metodo non può fornire informazioni sulle abbondanze relative delle sottopopolazioni mitocondriali o sottoinsiemi. Mentre è stato precedentemente ipotizzato che tutti i mitocondri son…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Laurie Destroismaisons e Sarah Peyrard per un supporto tecnico e Dr.Alexandre Prat per l'accesso al citofluorimetro. Vorremmo inoltre ringraziare il dottor Timothy Miller per il suo contributo per quanto riguarda la rimozione della mielina dai preparativi. Questo lavoro è stato supportato dal Canadian Institutes of Health Research (CIHR) Neuromuscular Research Partnership, Canadian Foundation for Innovation, ALS Society of Canada, la Fondazione Frick per la SLA Research, CHUM Fondazione e Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV). Sia CVV e NA sono studiosi di ricerca del Fonds de la Recherche en Santé du Québec e CIHR nuovi ricercatori. SP è sostenuto dalla Tim Noël Studentship dalla ALS Society of Canada.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ulara-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coultier | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex490 nm/Em516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex548 nm/Em574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex540 nm/Em600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BS FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
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