Techniques expérimentales et d'imagerie pour examen caillot de fibrine Structures en normaux et malades Unis
Summary
In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.
Abstract
Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.
Introduction
Des traumatismes de la paroi endothéliale d'un vaisseau sanguin est réparé par la réponse hémostatique, ou la formation d'un caillot de sang. Lorsque le sang pénètre dans la matrice extracellulaire, les facteurs tissulaires activer les plaquettes dans le flux de sang qui facilitent l'initiation de la cascade de coagulation. L'élément mécanique essentiel de ce processus de guérison est la matrice de fibrine, composé de fibres de fibrine qui sont hautement élastique, et peut supporter des forces importantes 1-4. De nombreux chercheurs ont étudié la structure de la formation, et la fonction de la fibrine abondamment dans les dernières décennies 5-13.
Les patients atteints de maladies telles que le diabète sucré et la drépanocytose ont un risque accru de développer des complications thrombotiques telles que l'infarctus du myocarde, la cardiopathie ischémique, les accidents vasculaires cérébraux et 14-19. Plus de 2 millions de personnes sont nouvellement diagnostiquées avec le diabète sucré chaque année aux États-Unis. Il existe deux types de diabète: type I, où lecorps ne parvient pas à produire des quantités adéquates d'insuline, et Type II, où le corps devient résistant à l'insuline. Chez les patients diabétiques, les maladies cardiovasculaires (CVD) est la cause de 80% de la morbidité et de la mortalité associée à la maladie 20,21.
La drépanocytose (SCD) est une maladie génétique du sang qui touche plus de 100 000 personnes aux États-Unis 22. SCD est une maladie point mutation qui provoque des globules rouges à devenir en forme de croissant, ce qui rend difficile pour les cellules de passer à travers le système vasculaire sanguin 23. Ces deux états pathologiques augmenter les chances de développer des maladies athérothrombotiques dans le corps. Une des raisons à cela est le résultat de la structure de fibrine modifié et la fonction dans les Etats malades 14,24-26.
Dans les deux diabète et la drépanocytose, il est hypercoagulation et l'activité de hypofibrinolyse qui induit l'athérothrombose et les maladies cardiovasculaires (CVD) par rapport à des patients sains 17,27,28. Il est connu que hypofibrinolyse favorise la progression de l'athérosclérose et engendre des événements ischémiques récurrents pour les patients atteints de maladie coronarienne prématurée 29. Dans le manuscrit en cours, nous avons étudié le rôle des propriétés physiques fibrine dans ce contexte particulier. Structures de caillot de fibrine chez les patients non malades sont composés de fibres fines et des pores plus grands, et généralement moins dense 14,24. La porosité accrue et des caillots de fibrine moins denses chez les patients en bonne santé ont été trouvées 16 pour faciliter la fibrinolyse. Dans des conditions hyperthrombotic telles que la maladie diabétique et la faucille cellule, il existe une augmentation de la production de fibrinogène, ce qui provoque la concentration de fibrinogène à augmenter à partir de niveaux normaux de 2,5 mg / ml dans 30 à 33 patients en bonne santé. Les caillots de fibrine formés chez les patients diabétiques se sont révélés être moins poreux, plus rigide, plus de points de ramification, et plus dense en comparaison avec sain, non-diapatients Bétique 14,24,33-35. La structure de fibrine modifiée est le résultat de mécanismes de glycation qui se produisent dans les protéines impliquées dans la formation du caillot. Non enzymatique (irréversible) glycation se produit lorsque les molécules de glucose se lient à des résidus de lysine sur la molécule de fibrinogène, qui inhibe le facteur XIIIa humaine (FXIIIa) à partir de résidus lysine et glutamine correctement reticulation 33,36,37.
L'analyse structurale des réseaux de fibrine a été largement étudié ces derniers temps. En particulier, les chercheurs ont utilisé la microscopie électronique et reconstruction 3D de réseaux de fibrine 38, a étudié comment les deux (endotheliales) Les piles et extravasculaires (fibroblastes et de muscle lisse) intravasculaires cellules influent sur la structure de fibrine 39, viscoélastique utilisé et l'analyse spectrale à analyser les structures de fibrine 40, et corrélations développés entre la structure de fibrine et les propriétés mécaniques utilisant des approches expérimentales et informatiques 41 </sup>. L'objectif de l'étude était de formuler des structures de caillot dans des conditions de thrombose cellulaire diabétique et la faucille simulées et d'utiliser la microscopie confocale pour l'examen de la structure et la fonction des caillots dans les États malades. Les caillots de fibrine ont été formés à partir de fibrinogène humain, de la thrombine humaine, et FXIIIa. Les caillots ont été lysées à l'aide de plasmine. Pour simuler les conditions diabétiques, augmentation de la concentration de fibrinogène a été incubé dans une solution de glucose pour induire in vitro fibrinogène glycation. Pour simuler les conditions de coagulation drépanocytaires, une augmentation des concentrations de fibrinogène ont été mélangés avec hématocrite falciforme recueillies auprès de patients comme précédemment par notre groupe 42. Ces méthodes ont été utilisées pour examiner la structure et les fonctions impliquées dans la formation de caillot de fibrine et de la fibrinolyse dans des conditions malades, ainsi que les mécanismes qui induisent les maladies cardiovasculaires. Basé sur l'information courante sur ces maladies, les structures de fibrine caillot glyquée étaient plus dense avec moins d'unnd pores plus petits. Les caillots de fibrine avec les globules rouges provenant de patients atteints de drépanocytose (RBC) étaient également plus dense et affichées agrégation des globules rouges et des grappes agglomérées de fibrine. Ce est un phénomène bien établi qui a été précédemment déterminé 43. On a également émis l'hypothèse que le taux de la fibrinolyse est sensiblement inférieure à la formation de caillots de fibrine avec ou sans glyquées réduite par rapport à la plasmine en bonne santé, la fibrine normal. Les résultats ont montré que, pour la formation de caillots de fibrine glyquées, des résultats sensiblement différents de taux de lyse n'a été observée que dans des conditions de concentration de la plasmine réduite. Cette technique expérimentale de l'utilisation de la microscopie confocale offre des avantages significatifs par rapport à d'autres méthodes d'imagerie parce que les cellules et les protéines restent dans leur état natif, ce qui permet la capture de vidéo en temps réel de l'activité de coagulation. Cette méthode de coagulation synthétiquement induction est également moins coûteux et plus efficace du temps que l'obtention d'échantillons de patients et le filtrage out individueldes protéines et des enzymes. En outre, en utilisant des protéines et des enzymes séparés de synthétiser des caillots, les caillots ont été normalisées de sorte qu'il n'y avait pas variabilité entre les échantillons à la suite d'autres protéines dans le plasma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour obtenir des données significatives sur la structure des mécanismes de coagulation dans des états pathologiques, il est important d'isoler les facteurs impliqués dans la coagulation pour déterminer les effets des protéines et des cellules dans ces conditions. Ce protocole a été développé pour les fins de l'enquête sur la structure du caillot de fibrine dans les états diabétiques et SCD in vitro.
Il est nécessaire de comprendre les mécanismes impliqués dan…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank the Lam Lab at Georgia Tech for many helpful discussions in developing the experimental assays. Research reported in this publication was supported by the National Heart, Lung, and Blood Institute of the National Institutes of Health under Award Number K01HL115486 and by New Innovator Grant 1DP2OD007433-01 from the Office of the Director, National Institutes of Health. The content is solely the responsibility of the authors and does not necessarily represent the official views of the National Institutes of Health.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| PBS | Life Technologies | 10010031 | |
| Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide) | GE Healthcare | 45-001-749 | |
| 10 ml heparinized vacutainer tubes | BD Biosciences | 366643 | |
| Human Fibrinogen | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate | Molecular Probes | F13191 | |
| 0.5 mL graduated microcentrifuge tube | Fisher Scientific | 05-408-120 | |
| Glucose powder | Life Technologies | 15023-02 | |
| FXIIIa | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| VIS Confocal Microscope | Zeiss LSM 510 | LSM 510 | |
| 50 mM Tris | Lonza | S50-642 | |
| Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | 449709-10G | |
| Vybrant DiD cell-labeling solution | Life Technologies | L7781 | |
| Plasmin | Enzyme Research Laboratories | N/A | |
| Sodium Chloride (5 M NaCl) | Life Technologies | AM9759 | |
| Statistical Modeling Software | IBM | SPSS Statistics 22 |
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