Técnicas Experimentais e de imagem para o exame de Estruturas do coágulo de fibrina em normais e doentes Unidos

Summary

In this manuscript, experimental techniques, including blood preparation, confocal microscopy, and lysis rate analysis, to examine the morphological differences between normal and abnormal clot structures due to diseased states are presented.

Abstract

Fibrin is an extracellular matrix protein that is responsible for maintaining the structural integrity of blood clots. Much research has been done on fibrin in the past years to include the investigation of synthesis, structure-function, and lysis of clots. However, there is still much unknown about the morphological and structural features of clots that ensue from patients with disease. In this research study, experimental techniques are presented that allow for the examination of morphological differences of abnormal clot structures due to diseased states such as diabetes and sickle cell anemia. Our study focuses on the preparation and evaluation of fibrin clots in order to assess morphological differences using various experimental assays and confocal microscopy. In addition, a method is also described that allows for continuous, real-time calculation of lysis rates in fibrin clots. The techniques described herein are important for researchers and clinicians seeking to elucidate comorbid thrombotic pathologies such as myocardial infarctions, ischemic heart disease, and strokes in patients with diabetes or sickle cell disease.

Introduction

Lesão de revestimento endotelial de um vaso sanguíneo é reparada através da resposta hemostática, ou a formação de um coágulo de sangue. Quando o sangue penetra na matriz extracelular, os factores de tecidos activar as plaquetas do sangue que facilitam a iniciação da cascata de coagulação. O componente mecânico chave deste processo de cicatrização é a matriz de fibrina, composto de fibras de fibrina que são altamente elástico, e pode suportar grandes forças de ^1-4. Muitos pesquisadores têm estudado a estrutura de formação e função de fibrina extensivamente nas últimas décadas ^13/05.

Pacientes com doenças como diabetes mellitus e falciforme têm um risco aumentado de desenvolvimento de complicações trombóticas, tais como infarto do miocárdio, doença isquêmica do coração e acidentes vasculares cerebrais ^14-19. Mais de 2 milhões de pessoas são diagnosticadas com diabetes mellitus a cada ano nos Estados Unidos. Existem dois tipos de diabetes: Tipo I, onde ocorpo não consegue produzir quantidades adequadas de insulina, e Tipo II, em que o corpo se torna resistente à insulina. Nos pacientes com diabetes, doença cardiovascular (DCV) é a causa de 80% da morbidade e mortalidade associadas com a doença ^20,21.

A doença falciforme (SCD) é uma desordem genética do sangue que afeta mais de 100 mil pessoas nos Estados Unidos ^22. SCD é uma doença ponto de mutação que faz com que as células vermelhas do sangue para se tornar em forma de crescente, fazendo com que seja difícil para as células que passam através da vasculatura sanguínea ^23. Ambos os estados de doença aumentar as possibilidades de desenvolver condições aterotrombóticas no corpo. Uma das razões para isso é o resultado da estrutura da fibrina alterada e função em estados doentes ^14,24-26.

Em ambas as diabetes e doença das células falciformes, há um estado de hipercoagulabilidade e hipofibrinólise actividade que induz a aterotrombose e doença cardiovascular (CVD), em comparação com pacientes saudáveis ^{​​17,27,28.} Sabe-se que hipofibrinólise promove a progressão da aterosclerose e gera eventos isquêmicos recorrentes para os pacientes com doença arterial coronariana prematura ^29. No manuscrito atual, nós investigamos o papel das propriedades físicas de fibrina neste cenário particular. Estruturas de coágulos de fibrina em pacientes não-doentes são compostas por fibras finas, poros de maiores dimensões, e geralmente menos densa ^14,24. O aumento da porosidade e coágulos de fibrina menos densas em pacientes saudáveis, foram encontrados para facilitar a fibrinólise ^16. Em condições hyperthrombotic tais como a doença de células falciformes e diabética, há um aumento na produção de fibrinogénio, fazendo com que a concentração de fibrinogénio a partir de aumentar os níveis normais de 2,5 mg / ml em pacientes saudáveis ^​​30-33. Coágulos de fibrina formados em pacientes diabéticos têm sido encontrados para ser menos poroso, mais rígida, têm mais pontos de ramificação, e mais denso quando comparado com saudável, não-diâmpacientes Bética ^14,24,33-35. A estrutura de fibrina é alterada um resultado de glicação de mecanismos que ocorrem nas proteínas envolvidas na formação do coágulo. Não enzimática (irreversível) glicação ocorre quando as moléculas de glicose se ligar a resíduos de lisina na molécula de f ibrinogénio, que inibe XIIIa factor humano (FXIIIa) de glutamina e lisina apropriadamente de reticulação ^33,36,37.

A análise estrutural de redes de fibrina tem sido extensivamente estudado recentemente. Em particular, os pesquisadores utilizaram microscopia eletrônica e reconstrução 3D de redes de fibrina ^38, investigou como ambas as células e extravasculares (fibroblastos e do músculo liso) intravascular (células endoteliais) afetam a estrutura da fibrina ^39, viscoelástico utilizados e análise espectral para analisar estruturas de fibrina ^40, e correlações desenvolvidos entre a estrutura da fibrina e propriedades mecânicas usando experimental e computacional se aproxima ⁴¹ </sup>. O foco do estudo foi a formulação de estruturas coágulo em condições trombose célula diabética e foice simulados e usar microscopia confocal para análise da estrutura e função dos coágulos nos estados doentes. Coágulos de fibrina foram formados a partir de fibrinogénio humano, trombina humana, e FXIIIa. Os coágulos foram lisadas utilizando plasmina. Para simular condições diabéticas, o aumento da concentração de fibrinogénio foi incubada em solução de glicose para induzir in vitro fibrinogénio glicação. Para simular a doença de células falciformes condições de coagulação, o aumento da concentração de fibrinogênio foram misturados com hematócrito falciforme coletadas de pacientes como feito anteriormente pelo nosso grupo ^42. Estes métodos foram usados ​​para examinar a estrutura e as funções envolvidas na formação do coágulo de fibrina e fibrinólise sob condições de doença, bem como os mecanismos que induzem a DCV. Com base em informações atuais sobre essas doenças, as estruturas do coágulo de fibrina glicada foram mais denso com menos umnd poros menores. Os coágulos de fibrina com hemácias de pacientes com anemia falciforme (hemácias) também eram mais densas e exibido agregação das hemácias e aglomerados de fibrina aglomeradas. Este é um fenômeno bem estabelecido que tenha sido determinado anteriormente ^43. Também foi levantada a hipótese de que a taxa de fibrinólise seria significativamente menor nos coágulos de fibrina glicada com e sem plasmina reduzida em comparação com saudável, normal, de fibrina. Os resultados mostraram que, para a formação de coágulos de fibrina glicada, resultados significativamente diferentes taxas de lise foram observados apenas sob condições de baixa concentração de plasmina. Esta técnica experimental utilizando microscopia confocal oferece vantagens significativas sobre outros métodos de imagem, porque as células e proteínas permanecem no seu estado nativo, que permite a captação de vídeo em tempo real da actividade de coagulação. Este método de coagulação sinteticamente indutor também é mais barato e mais eficiente do que o tempo de obtenção de amostras de pacientes e filtrar indivíduoproteínas e enzimas. Além disso, utilizando proteínas e enzimas separados para sintetizar a formação de coágulos, os coágulos foram normalizados de modo que não existe variabilidade entre as amostras, como resultado de outras proteínas do plasma.

Protocol

NOTA: O protocolo a seguir segue as diretrizes estabelecidas pelo Conselho de Revisão Institucional (IRB) no Georgia Tech. 1. Coleta de Sangue e Blood Red isolamento de células Procedimento Recolha 40-120 ml de sangue de doadores em 10 ml tubos Vacutainer contendo heparina. Comece PBMC (célula mononucleated sangue periférico) isolamento dentro de 4 horas da coleta. Durante este tempo, manter o sangue à temperatura ambiente. NOTA: O armazenamento / N de sangue na RT ou …

Representative Results

Microscopia Confocal Análise de glicada fibrina Coágulo Estruturas As imagens de microscopia confocal de coágulos normais e glicadas são apresentados na Figura 3. A análise por microscopia confocal dos coágulos normais e glicada revela que a formação de coágulos glicada são mais densos com poros mais pequenos do que os coágulos normais ambos com e sem a adição de FXIIIa coágulo durante a polimerização. Na Figura 3A e 3B, não…

Discussion

Para obter dados significativos sobre a estrutura de mecanismos de coagulação em estados de doença, é importante isolar os factores implicados na coagulação para determinar os efeitos das proteínas e células nestas condições. Este protocolo foi desenvolvido para os efeitos da análise da estrutura de coágulo de fibrina em estados diabéticos e DF in vitro.

É necessário compreender os mecanismos envolvidos na formação de fibrina e fibrinólise em estados de doença, de…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
PBS	Life Technologies	10010031
Ficoll-Paque (hydrophilic polysaccharide)	GE Healthcare	45-001-749
10 ml heparinized vacutainer tubes	BD Biosciences	366643
Human Fibrinogen	Enzyme Research Laboratories	N/A
Alexa Fluor 488 human fibrinogen conjugate	Molecular Probes	F13191
0.5 mL graduated microcentrifuge tube	Fisher Scientific	05-408-120
Glucose powder	Life Technologies	15023-02
FXIIIa	Enzyme Research Laboratories	N/A
VIS Confocal Microscope	Zeiss LSM 510	LSM 510
50 mM Tris	Lonza	S50-642
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma Aldrich	449709-10G
Vybrant DiD cell-labeling solution	Life Technologies	L7781
Plasmin	Enzyme Research Laboratories	N/A
Sodium Chloride (5 M NaCl)	Life Technologies	AM9759
Statistical Modeling Software	IBM	SPSS Statistics 22