כמותי Immunofluorescence Assay למדוד הווריאציה ברמות חלבון בCentrosomes
Summary
Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.
Abstract
Centrosomes הם אברונים קטנים אך חשובים, המשמשים כקטבים של ציר mitotic כדי לשמור על שלמות הגנומי או להרכיב cilia העיקרי כדי להקל על פונקציות חושיות בתאים. רמת חלבון עשויה להיות מוסדרת באופן שונה בcentrosomes מאשר במקומות אחרים .cellular, והשינוי ברמת centrosomal של כמה חלבונים בנקודות שונות של מחזור התא נראה חיוני לוויסות הנכונה של ההרכבה צנטריול. פיתחנו assay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותיים המודד שינויים יחסי ברמת חלבון בcentrosomes בתאים קבועים ממדגמים שונים, כגון בשלבים שונים של מחזור התא או לאחר טיפול בחומרים כימיים שונים. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן המתאימה לחלבון באזור קטן, ולנרמל את המדידה שנגד אותם לחלבון אחר שאינו משתנה על פי ג הניסיוני נבחרondition. ניצול assay זה בשילוב עם דופק BrdU ואסטרטגיה מרדף ללמוד מחזורי תא מוטרדים, יש לנו כמותית תוקף התצפית האחרונה שלנו כי בריכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת בcentrosomes במהלך מחזור התא, סביר להניח בשפלה בתיווך פרוטאזום במיוחד בcentrosomes.
Introduction
Centrosomes מורכב של זוג centrioles מוקף חומר pericentriolar (PCM). להיות המרכזים המארגנים microtubule הגדולות (MTOCs) בתאי יונקים, centrosomes לשמש כשני הקטבים של צירים mitotic בתאים מתחלקים, ובכך לסייע לשמור על שלמות הגנומי 1. בתאים שקטים (לדוגמא, בשלב G0), אחד משני centrioles של centrosome, כלומר צנטריול אמא, הופך לגוף בסיסי להרכיב cilium העיקרי, אברון חושי הבולט החוצה מתא השטח 2. ברגע שהתאים להזין מחדש את מחזור התא, cilia העיקרי מפורק וכל צנטריול מכוון את ההרכבה של procentriole בקצה הפרוקסימלי שלה שמתארך בהדרגה ליצירת צנטריול בוגר 3. בתחילת S-שלב, מבנה דמוי גלגלון-המספק הסימטריה 9 פי לצנטריול נוצר על פני השטח של כל צנטריול הקיים ויהפוך את הבסיס של כל procentriole. t Sas6כובע הוא הכרחי להרכבת צנטריול מגויסת כדי ליצור את הרכזת של גלגלון 4-6. לאחר מכן חלבוני centriolar אחרים הם התאספו על גלגלון בפיקוח הדוק, הפרוקסימלי לאופן דיסטלי 7. לאחר שסיים בדיוק כפילות צנטריול, תאים להרכיב חומרי pericentriolar נוספים לבניית שתי centrosomes פונקציונלי בסוף שלב G2 8. בנוסף לרכיבי ליבת centriolar 9-11, כמה חלבונים אחרים, כולל קינאז, phosphatases, מלווים, רכיבי פיגום, חלבונים הקשורים קרום ומכונות השפלה משויך centrioles, גופים בסיסיים וPCM בזמנים שונים של מחזור התא 12-16. הוא ציין כי לעתים קרובות רמות centrosomal של חלבונים רבים מוסדרות באופן זמני על ידי מנגנוני מיקוד centrosomal ו / או השפלה proteasomal בcentrosomes. חשוב לציין, התנודות ברמת centrosomal של כמה חלבונים כגון Plk4, Mps1, Sas6, וCP110נקודות שונות t של מחזור התא נראית חיוני להסדיר הרכבה צנטריול 5,17-22, ובמקרה של Mps1 מניעת השפלה centrosomal זה מוביל להיווצרות של centrioles העודף 19. מצד השני, השברים centrosomal של כמה חלבונים הם פחות יציבים בהשוואה לבריכות cytosolic. לדוגמא siRNA בתיווך למטה ויסות של Centrin 2 (Cetn2) הוביל לירידה מתונה בלבד של רמת החלבון בcentrioles למרות ירידה גדולה ברמות התא כולו 23. לכן זה חיוני כדי למדוד את השינויים ברמה של חלבוני centrosomal בcentrosome ולא מדידת רמות חלבון תא כל עת הערכת פונקציות centrosome הספציפית שלהם.
במחקר זה פיתחנו assay באמצעות immunofluorescence העקיף (IIF) לכמת את הרמה היחסית של חלבון בcentrosomes. assay זו פותח במיוחד לאבחון תאים שנמצאים ממדגמים שוניםולכן לא יכול להיות צילם באותו הזמן. דגימות אלה יכולים להיות תאים שטופלו בחומרים כימיים שונים (כלומר, תרופה לעומת קבוצת ביקורת), שנאספו בנקודות זמן שונות (כלומר, דופק לעומת מרדף), או נמצאים בשלבים שונים של מחזור התא. העיקרון של assay זה טמון במדידת עוצמת ניאון הרקע תיקן מתאים לחלבון באזור קטן ולנרמל את הערך שנגד אותם לחלבון אחר שרמות לא להשתנות תחת תנאי ניסוי נבחרו. מספר מחקרים בביולוגיה centrosome לאחרונה נצלו טכניקות שונות כמותי מיקרוסקופיה, בשני תאי החיים או קבועים, כדי לקבוע את פונקצית centrosome הספציפית של חלבוני מועמד 24-27. בדומה למבחנים אלה, הטכניקה הנוכחית גם מודדת את עוצמת הקרינה הרקע המתוקנת של חלבון המבחן. עם זאת, ההכללה של הנורמליזציה באמצעות תקן פנימי בassay זה היית צפוי להציע יותרדיוק וביטחון בניתוח שני מדגמים שונים שנמצאים בשני coverslips שונה. יתר על כן, בנוסף לבחינה של רמת החלבון בcentrosomes, עם התאמות קלות בשיטה זו יכולה להיות מיושמת על קבוצה מגוונת של תנאי ניסוי או באתרים סלולריים אחרים.
כאן, אנו משלבים assay מיקרוסקופיה הכמותי שלנו עם אסטרטגית דופק מרדף BrdU להשוות תאים משלבי מחזור התא שונים. במקום להשתמש בטכניקות עצירת מחזור התא סטנדרטית ושחרור ללמוד נקודות שונות בזמן מחזור התא, תאים גדלו באופן אסינכרוני מודגרת עם BrdU לתייג תאים בS-שלב, והתאים שכותרתו נרדפים לזמנים שונים (בדרך כלל 4-6 שעות). רוב התאים שכותרתו יהיה בשלב S-מייד לאחר הדופק. אורכו של המרדף נבחר כך שלאחר המרדף, תאים שכותרתו יהיו בS, G2, או מיטוזה מאוחר, אשר יכול להיות מאומת על ידי מאפיינים מורפולוגיים עמדת As- כזה של centrosomes ביחס לnucליי, מרחק בין centrosomes, עיבוי של כרומוזומים וכו 'לכן, לאורכו של המרדף תלוי במח"מ של S, G2 ושלב M של סוג תא מסוים. מאז גישה זו נמנעת מעכבי מחזור התא כגון hydroxyurea, aphidicolin, nocodazole, וכו ', זה מאפשר יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית ניתוח מחזור התא.
לפיכך, אנו מראים כאן שassay מיקרוסקופ פלואורסצנטי כמותית בלבד, או בשילוב עם assay דופק המרדף BrdU, הוא טכניקה פשוטה אך רבת עוצמה כדי למדוד במדויק את השינויים יחסי ברמת centrosomal של חלבון מועמד במהלך מחזור תא מוטרד. מדדנו את רמת centrosomal של VDAC3, חלבון שזיהינו לאחרונה בcentrosomes בנוסף למיטוכונדריה 16,28, באמצעות מבחני אלה. תוצאות שהתקבלו כאן לאמת התצפית הקודמת שלנו שברכת centrosomal של VDAC3 מוסדרת על ידי השפלה, וגם משתנה בdependen מחזור התאאופן t 16, יתר על כן אימות תחולתה של שיטה זו.
Protocol
Representative Results
Discussion
מיקרוסקופיה כמותי בביולוגיה של תא היא נפוצה הקשורים מבחני Live- תא הדמיה כגון העברת הקרינה תהודה אנרגיה (סריג), שחזור הקרינה לאחר photobleaching (FRAP), וכו 'עם זאת, יש דוגמאות הולך וגדל של ביולוגים של תא פיתוח מבחני כמותיים מיקרוסקופיה שונות לקבועים תאים בשנים האחרונות <sup…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by a National Institutes of Health grant (GM77311) and a seed grant from The Ohio Cancer Research Associates (to H.A.F.). SM was partially supported by an Up on the Roof fellowship from the Human Cancer Genetics Program of The Ohio State University Comprehensive Cancer Center.
Materials
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| Fibronectin | Sigma | F8141 | Stock of 1 mg/ml in water |
| DMSO | Sigma | D2650 | |
| MG115 | Sigma | SCP0005 | Stock of 10 mM in DMSO |
| BrdU | Sigma | B5002 | Stock of 10 mM in DMSO |
| Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88) | Sigma | T 6557 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal) | Aviva Systems Biology | ARP35180-P050 | 1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-Sas6 (mouse monoclonal) | Santa cruz biotechnology | sc-81431 | 1:100 in IIF blocking buffer |
| Anti-Cep135 (rabbit polyclonal) | Abcam | ab-75005 | 1:500 in IIF blocking buffer |
| Anti-BrdU (rat monoclonal) | Abcam | ab6326 | 1:250 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L) | Life technologies | A21093 | 1:200 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21202 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21203 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21206 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life technologies | A21207 | 1:1000 in IIF blocking buffer |
| Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal) | Sigma | T5192 | 1:1000 in WB blocking buffer |
| Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A) | Sigma | T9026 | 1:20000 in WB blocking buffer |
| Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) | Life technologies | A10043 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated | Rockland antibodies | 610-731-002 | 1:10000 in WB blocking buffer |
| SlowFade Gold Antifade Reagent | Life technologies | S36936 | Mounting media |
| Round coverslips 12CIR.-1 | Fisherbrand | 12-545-80 | |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | ||
| Retiga ExiFAST 1394 IR camera | QImaging | 32-0082B-238 | |
| 100X Plan Apo oil immersion objective | Olympus | 1.4 numerical aperture | |
| Slidebook software package | Intelligent Imaging Innovations | ||
| Odyssey IR Imaging System | Li-cor Biosciences | ||
| Bicinchoninic acid (BCA) assay | Thermo Scientific | 23227 | |
| U-MNU2 Narrow UV cube | Olympus | U-M622 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Blue cube | Olympus | U-M643 | Filter |
| U-MNU2 Narrow Green cube | Olympus | U-M663 | Filter |
References
- Ganem, N. J., Godinho, S. A., Pellman, D. A mechanism linking extra centrosomes to chromosomal instability. Nature. 460, 278-282 (2009).
- Kobayashi, T., Dynlacht, B. D. Regulating the transition from centriole to basal body. J. Cell Biol. 193, 435-444 (2011).
- Azimzadeh, J., Marshall, W. F. Building the centriole. Curr. Biol. 20, 816-825 (2010).
- Nakazawa, Y., Hiraki, M., Kamiya, R., Hirono, M. SAS-6 is a cartwheel protein that establishes the 9-fold symmetry of the centriole. Curr. Biol. 17, 2169-2174 (2007).
- Strnad, P., et al. Regulated HsSAS-6 levels ensure formation of a single procentriole per centriole during the centrosome duplication cycle. Dev. Cell. 13, 203-213 (2007).
- Hilbert, M., et al. Caenorhabditis elegans centriolar protein SAS-6 forms a spiral that is consistent with imparting a ninefold symmetry. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 110, 11373-11378 (2013).
- Pike, A. N., Fisk, H. A. Centriole assembly and the role of Mps1: defensible or dispensable. Cell Div. 6, 9 (2011).
- Haren, L., Stearns, T., Luders, J. Plk1-dependent recruitment of gamma-tubulin complexes to mitotic centrosomes involves multiple PCM components. PLoS One. 4, e5976 (2009).
- Andersen, J. S., et al. Proteomic characterization of the human centrosome by protein correlation profiling. Nature. 426, 570-574 (2003).
- Keller, L. C., Romijn, E. P., Zamora, I., Yates, J. R., Marshall, W. F. Proteomic analysis of isolated chlamydomonas centrioles reveals orthologs of ciliary-disease genes. Curr. Biol. 15, 1090-1098 (2005).
- Kumar, A., Rajendran, V., Sethumadhavan, R., Purohit, R. CEP proteins: the knights of centrosome dynasty. Protoplasma. 250, 965-983 (2013).
- Kanai, M., et al. Physical and functional interaction between mortalin and Mps1 kinase. Genes Cells. 12, 797-810 (2007).
- Jakobsen, L., et al. Novel asymmetrically localizing components of human centrosomes identified by complementary proteomics methods. Embo. J. 30, 1520-1535 (2011).
- Sang, L., et al. Mapping the NPHP-JBTS-MKS protein network reveals ciliopathy disease genes and pathways. Cell. 145, 513-528 (2011).
- Dowdle, W. E., et al. Disruption of a ciliary B9 protein complex causes Meckel syndrome. Am. J. Hum. Genet. 89, 94-110 (2011).
- Majumder, S., Slabodnick, M., Pike, A., Marquardt, J., Fisk, H. A. VDAC3 regulates centriole assembly by targeting Mps1 to centrosomes. Cell Cycle. 11, 3666-3678 (2012).
- Guderian, G., Westendorf, J., Uldschmid, A., Nigg, E. A. Plk4 trans-autophosphorylation regulates centriole number by controlling betaTrCP-mediated degradation. J. Cell Sci. 123, 2163-2169 (2010).
- Holland, A. J., et al. The autoregulated instability of Polo-like kinase 4 limits centrosome duplication to once per cell cycle. Genes Dev. 26, 2684-2689 (2012).
- Kasbek, C., et al. Preventing the degradation of mps1 at centrosomes is sufficient to cause centrosome reduplication in human cells. Mol. Biol. Cell. 18, 4457-4469 (2007).
- Kasbek, C., Yang, C. H., Fisk, H. A. Antizyme restrains centrosome amplification by regulating the accumulation of Mps1 at centrosomes. Mol. Biol. Cell. 21, 3878-3889 (2010).
- Puklowski, A., et al. The SCF-FBXW5 E3-ubiquitin ligase is regulated by PLK4 and targets HsSAS-6 to control centrosome duplication. Nat. Cell Biol. 13, 1004-1009 (2011).
- Spektor, A., Tsang, W. Y., Khoo, D., Dynlacht, B. D. Cep97 and CP110 suppress a cilia assembly program. Cell. 130, 678-690 (2007).
- Salisbury, J., Suino, K., Busby, R., Springett, M. Centrin-2 is required for centriole duplication in Mammalian cells. Curr. Biol. 12, 1287 (2002).
- Lukasiewicz, K. B., et al. Control of centrin stability by Aurora A. PLoS One. 6, e21291 (2011).
- Zhao, J., Ren, Y., Jiang, Q., Feng, J. Parkin is recruited to the centrosome in response to inhibition of proteasomes. J. Cell Sci. 116, 4011-4019 (2003).
- Korzeniewski, N., et al. Cullin 1 functions as a centrosomal suppressor of centriole multiplication by regulating polo-like kinase 4 protein levels. Cancer Res. 69, 6668-6675 (2009).
- Rohatgi, R., Milenkovic, L., Corcoran, R. B., Scott, M. P. Hedgehog signal transduction by Smoothened: pharmacologic evidence for a 2-step activation process. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 3196-3201 (2009).
- Majumder, S., Fisk, H. A. VDAC3 and Mps1 negatively regulate ciliogenesis. Cell Cycle. 12, 849-858 (2013).
- Howell, B. J., Hoffman, D. B., Fang, G., Murray, A. W., Salmon, E. D. Visualization of Mad2 dynamics at kinetochores, along spindle fibers, and at spindle poles in living cells. J. Cell Biol. 150, 1233-1250 (2000).
- Meraldi, P., Nigg, E. A. Centrosome cohesion is regulated by a balance of kinase and phosphatase activities. J. Cell Sci. 114, 3749-3757 (2001).
- Zimmerman, W. C., Sillibourne, J., Rosa, J., Doxsey, S. J. Mitosis-specific anchoring of gamma tubulin complexes by pericentrin controls spindle organization and mitotic entry. Mol. Biol. Cell. 15, 3642-3657 (2004).
- Lee, K., Rhee, K. PLK1 phosphorylation of pericentrin initiates centrosome maturation at the onset of mitosis. J. Cell Biol. 195, 1093-1101 (2011).
- Lin, Y. C., et al. Human microcephaly protein CEP135 binds to hSAS-6 and CPAP, and is required for centriole assembly. Embo. J. 32, 1141-1154 (2013).
- Lichtenstein, N., Geiger, B., Kam, Z. Quantitative analysis of cytoskeletal organization by digital fluorescent microscopy. Cytometry A. 54, 8-18 (2003).
- Keller, L. C., et al. Molecular architecture of the centriole proteome: the conserved WD40 domain protein POC1 is required for centriole duplication and length control. Mol. Biol. Cell. 20, 1150-1166 (2009).
- Venoux, M., et al. Poc1A and Poc1B act together in human cells to ensure centriole integrity. J. Cell Sci. 126, 163-175 (2013).
- Stevens, N. R., Roque, H., Raff, J. W. DSas-6 and Ana2 coassemble into tubules to promote centriole duplication and engagement. Dev. Cell. 19, 913-919 (2010).
- Machiels, B. M., et al. Detailed analysis of cell cycle kinetics upon proteasome inhibition. Cytometry. 28, 243-252 (1997).
- Yang, C. H., Kasbek, C., Majumder, S., Yusof, A. M., Fisk, H. A. Mps1 phosphorylation sites regulate the function of centrin 2 in centriole assembly. Mol. Biol. Cell. 21, 4361-4372 (2010).
- Tsou, M. F., et al. Polo kinase and separase regulate the mitotic licensing of centriole duplication in human cells. Dev. Cell. 17, 344-354 (2009).
- Salic, A., Mitchison, T. J. A chemical method for fast and sensitive detection of DNA synthesis in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 2415-2420 (2008).
- Buck, S. B., et al. Detection of S-phase cell cycle progression using 5-ethynyl-2′-deoxyuridine incorporation with click chemistry, an alternative to using 5-bromo-2′-deoxyuridine antibodies. Biotechniques. 44, 927-929 (2008).
- Waters, J. C. Accuracy and precision in quantitative fluorescence microscopy. J. Cell Biol. 185, 1135-1148 (2009).
