Quantitative Immunofluorescence Assay misurare la variazione dei livelli di proteine ​​ad centrosomi

Summary

Here, a novel quantitative fluorescence assay is developed to measure changes in the level of a protein specifically at centrosomes by normalizing that protein’s fluorescence intensity to that of an appropriate internal standard.

Abstract

Centrosomi sono piccoli ma importanti organelli che servono come i poli di mitotico mandrino per mantenere l'integrità genomica o assemblare cilia primario per agevolare le funzioni sensoriali nelle cellule. Il livello di una proteina può essere regolata in modo diverso a centrosomes rispetto ad altre posizioni .cellular, e la variazione nel livello centrosomica di diverse proteine ​​in punti diversi del ciclo cellulare sembra essere cruciale per la corretta regolazione del complessivo centriolo. Abbiamo sviluppato un microscopio a fluorescenza dosaggio quantitativo che misura variazioni relative del livello di una proteina a centrosomes in cellule fisse di diversi campioni, come in diverse fasi del ciclo cellulare o dopo trattamento con vari reagenti. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione, e normalizzare che misura contro lo stesso per un'altra proteina che non varia con il c sperimentale presceltoondition. Utilizzando questo test, in combinazione con l'impulso BrdU e la strategia caccia di studiare cicli cellulari imperturbati, abbiamo quantitativamente convalidato la nostra recente osservazione che il pool di centrosomica VDAC3 è regolata a centrosomi durante il ciclo cellulare, probabilmente dalla degradazione proteasoma-mediata specificamente a centrosomi.

Introduction

Centrosomi costituiti da una coppia di centrioli circondate da materiale pericentriolar (PCM). Essendo i principali centri di organizzazione dei microtubuli (MTOC) in cellule di mammifero, centrosomi servono come i due poli di fusi mitotici nelle cellule in divisione, e quindi aiutano a mantenere l'integrità genomica ^1. Nelle cellule quiescenti (ad esempio, durante la fase G0), uno dei due centrioli del centrosoma, cioè centriolo madre, si trasforma in un corpo basale per assemblare il cilium primaria, un organello sensoriale sporge dalla superficie cellulare ^2. Una volta che le cellule ri-entrare nel ciclo cellulare, cilia primaria sono smontati e ogni centriolo dirige il montaggio di un procentriole alla sua estremità prossimale che allunga progressivamente a formare una centriolo maturo ^3. All'inizio della fase S, una struttura di carro-like che fornisce la simmetria 9 volte al centriolo è formata sulla superficie di ciascun centriole esistente e diventerà la base di ogni procentriole. SAS6 tcappello è indispensabile per il montaggio centriolo viene reclutato per formare il fulcro della Cartwheel ^4-6. Altre proteine ​​centriolar vengono poi assemblati sul cartwheel in un altamente regolamentato, prossimale a distale maniera ^7. Dopo aver completato proprio centriolo duplicazione, cellule assemblare materiali pericentriolar supplementari per la costruzione di due centrosomi funzionali entro la fine della fase G2 ^8. Oltre ai componenti centriolar base ^9-11, diverse altre proteine ​​tra cui chinasi, fosfatasi, accompagnatori, componenti del ponteggio, proteine ​​associate membrana e macchinari degrado sono associate a centrioli, corpi basali e PCM in momenti diversi del ciclo cellulare ^12-16. Si è spesso osservato che i livelli centrosomica di molte proteine ​​sono temporalmente regolati da meccanismi di targeting centrosomica e / o degradazione del proteasoma in centrosomes. È importante sottolineare che le fluttuazioni del livello centrosomica di diverse proteine ​​come Plk4, Mps1, SAS6, e CP110 unt diversi punti del ciclo cellulare sembra essere essenziale per regolare centriole assemblaggio ^5,17-22, e nel caso di Mps1 prevenire questa degradazione centrosomica porta alla formazione di centrioli eccesso ^19. D'altra parte, le frazioni centrosomica di diverse proteine ​​sono meno labile rispetto alle piscine citosolici. Per esempio siRNA-mediata down-regulation di Centrin 2 (Cetn2) ha comportato solo una riduzione moderata del livello di proteine ​​nelle centrioli nonostante grande riduzione dei suoi livelli di cellule intere ^23. E 'quindi fondamentale per misurare le variazioni del livello delle proteine ​​centrosomica al centrosoma, piuttosto che misurare i livelli di proteine ​​intere cellule nel valutare le loro funzioni specifiche centrosoma.

In questo studio abbiamo sviluppato un saggio con immunofluorescenza indiretta (IIF) per quantificare il livello relativo di una proteina a centrosomi. Questo test è stato sviluppato in particolare per analizzare cellule che sono da diversi campionie quindi non può essere ripreso contemporaneamente. Questi campioni possono essere le cellule che sono stati trattati con diversi reagenti (cioè, farmaco contro controllo), raccolti in diversi momenti (ad esempio, impulsi contro chase), o sono in diverse fasi del ciclo cellulare. Il principio di questo test consiste nel misurare l'intensità di fluorescenza di fondo corretta corrispondente ad una proteina in una piccola regione e per normalizzare tale valore contro lo stesso per un'altra proteina i cui livelli non variano nelle condizioni sperimentali adottate. Diversi studi in biologia centrosome hanno recentemente utilizzato varie tecniche di microscopia quantitative, in entrambe le cellule vive o fissi, per determinare la funzione specifica centrosoma di proteine ​​candidate ^24-27. Simile a tali saggi, la tecnica attuale misura anche il fondo corretta intensità di fluorescenza della proteina. Tuttavia, l'inclusione della normalizzazione usando uno standard interno in questo saggio sarebbe probabilmente offrire maggiorela precisione e la fiducia ad analizzare due campioni diversi che si trovano su due lamelle differenti. Inoltre, oltre ad esaminare il livello di proteine ​​a centrosomes, con piccole modifiche questo metodo può essere applicato ad un insieme eterogeneo di condizioni sperimentali o in altri siti cellulari.

Qui, uniamo la nostra analisi di microscopia quantitativa con una strategia di pulse-chase BrdU per confrontare le cellule provenienti da diverse fasi del ciclo cellulare. Invece di utilizzare tecniche di arresto del ciclo cellulare normale e rilascio di studiare vari momenti del ciclo cellulare, le cellule in modo asincrono in crescita sono incubate con BrdU per etichettare le cellule in fase S, e le cellule marcate sono inseguiti per diverse volte (in genere 4-6 hr). La maggior parte delle cellule marcate saranno in fase S immediatamente dopo l'impulso. La lunghezza della caccia è scelto in modo che dopo la caccia, cellule marcate saranno in ritardo S, G2 o mitosi, che può essere verificata da caratteristiche morfologiche tale posizione as- di centrosomi rispetto nuclei, distanza tra centrosomi, condensazione di cromosomi ecc Quindi, la lunghezza della caccia dipende dalla durata media di S, G2 e M di fase di un particolare tipo di cellula. Poiché questo approccio evita inibitori del ciclo cellulare come idrossiurea, afidicolina, nocodazole, ecc, permette una analisi più fisiologicamente rilevanti ciclo cellulare.

Così, abbiamo dimostrato qui che la microscopia a fluorescenza quantitativa dosaggio soli, o in combinazione con BrdU test pulse-chase, è una tecnica semplice ma potente per misurare con precisione le relative variazioni del livello centrosomica di una proteina candidato durante un ciclo cellulare imperturbato. Abbiamo misurato il livello di centrosomica VDAC3, una proteina che abbiamo recentemente identificato in centrosomi, oltre ai mitocondri ^16,28, con questi test. I risultati ottenuti qui verificare la nostra osservazione precedente che il pool di centrosomica VDAC3 è regolato da degrado, e varia anche in un dependen ciclo cellularet modo ^16, inoltre, convalida l'applicabilità di questo metodo.

Protocol

Cultura 1. Cella Utilizzare telomerasi umana trascrittasi inversa (hTERT) cellule epiteliali del pigmento retinico immortalati (hTERT-RPE1, di cui qui RPE1). NOTA: le cellule RPE1 sono quasi diploide, non trasformati cellule umane che sono comunemente usati per studiare l'assemblaggio centriolo e ciliogenesis. Queste cellule seguono un normale ciclo di duplicazione centriolo coordinato con un ciclo cellulare regolamentato. Passaggio un quasi confluenti 100 millimetri piatto di coltura cel…

Representative Results

I nostri studi recenti identificati romanzo localizzazione centrosomica e la funzione di VDAC3, uno dei porine mitocondriali 16,28. Immunostaining di diverse cellule di mammiferi, tra cui le cellule RPE1 utilizzando un anticorpo VDAC3 specifico ha mostrato prominente colorazione centrosomica e relativamente debole colorazione mitocondriale. Abbiamo anche dimostrato che VDAC3 centrosomica è preferenzialmente associata al centriolo madre, e la piscina centrosomica sia endogeno e ectopicamente espresso VDAC3 è…

Discussion

Microscopia quantitativa in biologia cellulare è comunemente associato con live-cell test di imaging come la Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET), Recupero della fluorescenza dopo photobleaching (FRAP), ecc, tuttavia, ci sono esempi di crescita di biologi cellulari di sviluppo diversi saggi microscopia quantitativi per fisso cellule negli ultimi anni ^27,34-36. È importante sottolineare che, progressi nella comprensione della biologia centrosoma spesso richiede la comprensione della funzion…

Materials

Name	Company	Catalog number	Comments
Fibronectin	Sigma	F8141	Stock of 1 mg/ml in water
DMSO	Sigma	D2650
MG115	Sigma	SCP0005	Stock of 10 mM in DMSO
BrdU	Sigma	B5002	Stock of 10 mM in DMSO
Anti-g-tubulin (mouse monoclonal, clone GTU 88)	Sigma	T 6557	1:200 in IIF blocking buffer
Anti-VDAC3 (rabbit polyclonal)	Aviva Systems Biology	ARP35180-P050	1:50 in IIF blocking buffer, 1:1000 in WB blocking buffer
Anti-Sas6 (mouse monoclonal)	Santa cruz biotechnology	sc-81431	1:100 in IIF blocking buffer
Anti-Cep135 (rabbit polyclonal)	Abcam	ab-75005	1:500 in IIF blocking buffer
Anti-BrdU (rat monoclonal)	Abcam	ab6326	1:250 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 350 Goat Anti-Rat IgG (H+L)	Life technologies	A21093	1:200 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21202	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21203	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21206	1:1000 in IIF blocking buffer
Alexa Fluor 594 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody	Life technologies	A21207	1:1000 in IIF blocking buffer
Anti-g-tubulin (rabbit polyclonal)	Sigma	T5192	1:1000 in WB blocking buffer
Anti-a-tubulin (mouse monoclonal, DM1A)	Sigma	T9026	1:20000 in WB blocking buffer
Alexa Fluor 680 Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)	Life technologies	A10043	1:10000 in WB blocking buffer
Mouse IgG (H&L) Antibody IRDye800CW Conjugated	Rockland antibodies	610-731-002	1:10000 in WB blocking buffer
SlowFade Gold Antifade Reagent	Life technologies	S36936	Mounting media
Round coverslips 12CIR.-1	Fisherbrand	12-545-80
Olympus IX-81 microscope	Olympus
Retiga ExiFAST 1394 IR camera	QImaging	32-0082B-238
100X Plan Apo oil immersion objective	Olympus		1.4 numerical aperture
Slidebook software package	Intelligent Imaging Innovations
Odyssey IR Imaging System	Li-cor Biosciences
Bicinchoninic acid (BCA) assay	Thermo Scientific	23227
U-MNU2 Narrow UV cube	Olympus	U-M622	Filter
U-MNU2 Narrow Blue cube	Olympus	U-M643	Filter
U-MNU2 Narrow Green cube	Olympus	U-M663	Filter