Protocol
उरुग्वे - जानवरों को शामिल प्रक्रियाओं पशु प्रयोगों के लिए मानद आयोग और के स्कूल ऑफ मेडिसिन, Universidad डी ला रिपब्लिका के निर्देशक बोर्ड ने मंजूरी दे दी 071140-000821-12 और 08052010 ° प्रोटोकॉल एन के अनुसार में प्रदर्शन किया गया.
चिकित्सीय एजेंट की 1 Sublingual प्रशासन
- चिकित्सीय एजेंट युक्त समाधान तैयार परीक्षण किया. माउस प्रति 10 μl की अधिकतम मात्रा का प्रबंधन करने के लिए एकाग्रता समायोजित करें.
नोट: साल्मोनेला enterica serovar से शुद्ध flagellin के लिए एस की पहली घातक खुराक से संक्रमित माउस में संरक्षण के लिए प्रेरित करने के इष्टतम खुराक Typhimurium निमोनिया सीरोटाइप 1 E1586, 100% मृत्यु दर के कारण 10 माइक्रोग्राम / माउस है. Flagellin समाधान monomers की रिहाई सुनिश्चित करने के लिए 5 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया जाना चाहिए. Flagellin शुद्धि के बारे में अधिक जानकारी के लिए संदर्भ 26 देखें.- वारअपनी आणविक आकार, पवित्रता, संवेदनशीलता प्रोटियोलिसिस करने और mucoadhesive एजेंटों के उपयोग के अनुसार अलग immunomodulatory एजेंटों की वाई प्रभावी एकाग्रता. प्रत्येक यौगिक इसके प्रभाव को अधिकतम करने के लिए परीक्षण किया जा के लिए इष्टतम एकाग्रता समायोजित करें. Intranasal मार्ग द्वारा पिछले अध्ययनों एक विशेष यौगिक के लिए आयोजित किया गया है, तो मांसल मार्ग से इसकी क्षमता का परीक्षण करने के लिए एक प्रारंभिक खुराक 5 से 10 गुना ज्यादा इस्तेमाल करते हैं.
- 5.5 मिलीग्राम / किग्रा Xylacine साथ 110 मिलीग्राम / किग्रा Ketamine युक्त एक कॉकटेल इंजेक्शन द्वारा चूहों चतनाशून्य और जानवरों 7 से 10 मिनट के लिए आराम करते हैं.
- धीरे पिछले पैरों में से एक का लुटेरा दबाकर उचित anaesthetization पुष्टि; अगर ठीक से पशु उत्तेजना के जवाब में स्थानांतरित नहीं किया जाएगा anaesthetized.
- संज्ञाहरण के तहत जबकि सूखापन को रोकने के लिए प्रत्येक माउस की आँखों पर पशु चिकित्सक मरहम की एक पतली परत फैल गई.
नोट: एक प्रणाली से लैस अगर isofluorane तरह Inhalatory एनेस्थेटिक्स भी बजाय Ketamine / Xylacine इस्तेमाल किया जा सकता हैप्रेरण कक्ष और नाक शंकु के साथ ped उपलब्ध है. जानवरों anaesthetise और मांसल मार्ग द्वारा immunostimulant प्रबंधन करना शामिल कक्ष का उपयोग करें. इसके तत्काल बाद निगलने से बचने और चिकित्सीय परिसर के अवशोषण की अनुमति के लिए संज्ञाहरण के तहत इसे रखने के लिए कम से कम 15 मिनट के लिए एक नाक शंकु के लिए पशु कनेक्ट. - Immunostimulant या वाहन नियंत्रण समाधान युक्त समाधान पिपेट; अंगूठे और गैर प्रमुख हाथ की तर्जनी का उपयोग माउस ले और ऊर्ध्वाधर स्थिति में पकड़.
- थोड़ा संदंश खोलने, जीभ के नीचे प्रमुख हाथ जगह बंद संदंश की एक जोड़ी का उपयोग और मध्यमा और अनामिका का उपयोग कर यह जगह में पकड़ जीभ लिफ्ट करने के लिए.
- पिपेट ले लो और जीभ के मुंह और पृष्ठीय पक्ष के फर्श पर समाधान प्रशासन.
- संदंश निकालें और पिंजरे में वापस डालने से पहले 3 मिनट से 5 के लिए माउस आराम करते हैं. यह सुनिश्चित करने के लिए कि normothermia anaesthetized mic में बनाए रखा हैई, एक पिंजरे हीटर प्रणाली को पिंजरों कनेक्ट. ऐसी प्रणाली उपलब्ध नहीं है, जगह चूहों बिस्तर के ऊपर एक दूसरे के बगल इसी पिंजरे एक में वापस एक ही इलाज समूह से संबंधित है और आंशिक रूप से उन्हें शरीर के तापमान को बनाए रखने में मदद करने के लिए स्वच्छ टिशू पेपर शीट के साथ उन्हें कवर.
- उपचार से प्रेरित सेल आबादी में परिवर्तन का विश्लेषण करने के लिए immunomodulatory एजेंट की टपकाना के बाद किसी भी समय बिंदु पर ऊतक के नमूने ले लीजिए.
नोट: flagellin के इस विशेष प्रोटोकॉल प्रशासन में चुनौती पहले 2 घंटे प्रदर्शन किया गया था. उपचार और चुनौती एक विशेष चिकित्सीय एजेंट के लिए और रोगाणु के बीच इष्टतम समय का निर्धारण परीक्षण किया.
स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया के साथ 2 जीवाणु निलंबन की तैयारी और intranasal चैलेंज
नोट: एस निमोनिया आक्रामक निमोनिया, पूति की तरह जीवन धमकी रोगों का कारण बन सकती है कि एक प्राकृतिक मानव रोगजनक हैऔर दिमागी बुखार. साँस या म्यूकोसा के साथ संपर्क में जब पारेषण हो सकती है. इसलिए, एस के साथ संपर्क में हो सकता है कि सभी नमूनों निमोनिया एक वर्ग द्वितीय जैव सुरक्षा कैबिनेट का उपयोग कर एक उपयुक्त biosecurity द्वितीय स्तर की सुविधा में नियंत्रित किया जाना चाहिए. सुरक्षात्मक कपड़े, अपशिष्ट निपटान और लागू कर सकते हैं कि अतिरिक्त सुरक्षा उपायों के लिए प्रकार द्वितीय रोगजनकों की हैंडलिंग के बारे में आपकी संस्था के मानक संचालन प्रक्रिया की जाँच करें. संक्रमित पशुओं HEPA फिल्टर के साथ सुसज्जित isolators में व्यक्तिगत रूप से हवादार पिंजरों में रखा जाना चाहिए. विरोधी न्यूमोकोकल टीके और एंटीबायोटिक उपचार उपलब्ध हैं. अधिक जानकारी के लिए 27 और 1 देखें.
- 15 में वर्णित के रूप में तैयार ज्ञात बैक्टीरियल CFU संख्या के स्ट्रैपटोकोकस निमोनिया के एक काम स्टॉक निलंबन के एक विभाज्य पिघलना.
- 2500 XG और आरटी पर 5 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और सेंट के 1 मिलीलीटर में यह निलंबित द्वारा बैक्टीरियल गोली धोनेerile खारा समाधान. जीवाणु निलंबन, dilutions या पशु चुनौती के लिए तैयार करते समय फिल्टर युक्तियों का उपयोग करें.
- फिर जैसे कदम 2.2 में वर्णित अपकेंद्रित्र.
- सतह पर तैरनेवाला त्यागें और 4x10 5 CFU / 50 μl के निलंबन प्राप्त करने के लिए बाँझ खारा की उचित मात्रा में गोली resuspend. इस खुराक एस की न्यूनतम बैक्टीरियल खुराक से मेल खाती है निमोनिया सीरोटाइप पिछले अध्ययनों 15 के अनुसार BALB / ग चूहों में 100% मृत्यु का कारण बनता है कि 1 E1586.
नोट: चूहों में न्यूमोकोकल निमोनिया के एक मॉडल की स्थापना करते हैं, तो कम से कम बैक्टीरिया खुराक मृत्यु दर के 100% बैक्टीरियल तनाव, सीरोटाइप और माउस तनाव का एक विशेष संयोजन के लिए निर्धारित किया जाना चाहिए के कारण. - Vortexing या नीचे 5 बार pipetting और से जीवाणु निलंबन homogenize.
- लोड एक बाँझ फिल्टर टिप का उपयोग जीवाणु निलंबन के 50 μl और एक anaesthetized माउस की नाक में कुल मात्रा टपकाना. माउस upri पकड़ो2 मिनट के लिए ght और यह 2 अधिक मिनट के लिए पृष्ठीय स्थिति में आराम करते हैं. आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम लागू करें और पिंजरे में जानवरों वापसी; संज्ञाहरण के तहत जबकि normothermia बनाए रखने के लिए सुनिश्चित करें.
नोट: इस अध्ययन में बैक्टीरिया चुनौती 15,28 में पहले से निर्धारित रूप में फेफड़ों में कुल CFU के कम से कम 90% का वितरण सुनिश्चित करने के लिए 50 μl की एक मात्रा में प्रदर्शन किया गया था. इस्तेमाल किया जा सकता है जानवर छोटे संस्करणों (जैसे, 20 μl) के संकट को कम करने के लिए. हालांकि, फेफड़ों में बैक्टीरिया की कुशल वितरण की जाँच की जानी चाहिए; इस चुनौती के बाद फेफड़ों 5 मिनट कटाई और रक्त अगर प्लेटों पर धारावाहिक dilutions चढ़ाना द्वारा फेफड़ों 'homogenates में CFU गिनती के द्वारा किया जा सकता है. - रक्त अगर प्लेटों पर धारावाहिक 10 गुना dilutions चढ़ाना द्वारा संक्रमण के लिए इस्तेमाल बैक्टीरियल निलंबन में CFU संख्या की पुष्टि करें. 5% सीओ 2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस हे / एन सेते हैं और अल का एक हरी हेलो विशेषता पेश mucoid कालोनियों की संख्या गिनतीपीएचए रक्तसंलायी बैक्टीरिया.
3 ऊतक संग्रह और फ्लो (FACS) विश्लेषण के लिए नमूना तैयार
3.1) ऊतक संग्रह
- ग्रीवा अव्यवस्था या सीओ 2 कक्ष का उपयोग करके पशु euthanize; गर्दन को वक्ष गुहा सभी तरह खुले और गर्दन और अवअधोहनुज क्षेत्र के उदर पक्ष को बेनकाब करने के लिए सामने पैर के साथ एक चीरा बनाने.
- ठीक टिप घुमावदार संदंश के साथ धीरे मुंह मंजिल के पृष्ठीय पक्ष को बेनकाब करने के लिए लार ग्रंथियों और आसन्न नरम ऊतक को खींच. 500 ml- 10% भ्रूण गोजातीय सीरम, 10,000 यू / मिलीलीटर युक्त समाधान के 5 एमएल के लिए, धीरे से ऊपर खींच कर जबड़े और गौण जबड़े लिम्फ नोड्स ले और पूरा RPMI (cRPMI युक्त ट्यूब में उन्हें जगह, घुमावदार पतली टिप संदंश का प्रयोग उस होगा बहाव प्रक्रिया के अनुसार पेनिसिलीन और 10 मिलीग्राम / मिलीलीटर स्ट्रेप्टोमाइसिन समाधान और 5 एमएल एल Glutamine 200 मिमी) या न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक समाधानबाद में बाहर किया जाना.
- वक्ष गुहा डायाफ्राम में एक चीरा बनाने खोलने के लिए; चूहे दांतेदार संदंश की एक जोड़ी ध्यान से उरोस्थि के xyphoid उपास्थि दबाना और उपयोग कर सच पसलियों उरोस्थि के manubrium मिलने जहां बिंदु तक पहुंचने तक सभी तरह झूठी पसलियों से शुरू दोनों पृष्ठीय पक्ष में पसलियों में कटौती.
- संदंश के साथ उरोस्थि के xyphoid उपास्थि धारण करके, वक्ष गुहा के अंगों को बेनकाब करने के लिए धीरे से ऊपर खींच.
- पूरी तरह से पहले पसलियों और हंसली काटने से पसलियों निकालें. थाइमस दिल के आधार पर छाती करीबी की anteroventral भाग में स्थित दो पालियों की एक सफेद संरचना के रूप में दिखाई देगा.
- संदंश की एक जोड़ी के साथ यह clamping द्वारा पालियों की एक लो और अपने अवर चेहरा और पेरीकार्डियम के बीच स्नायुबंधन दूर करने के लिए कैंची की एक जोड़ी का उपयोग करें. दूसरा पालि दूर करने के लिए आगे बढ़ें.
- उदर गुहा को पहचानें और मीटर की औसत अक्ष के साथ काटने से यह खुलाuscular दीवार अंगों को बेनकाब करने के लिए. संदंश की एक जोड़ी के साथ पीछे रग कावा और वक्ष महाधमनी में कटौती; एक शोषक ऊतक के साथ रक्त का अतिरिक्त हटा दें.
- Alveoli के निवासी और घुसपैठ सेल आबादी ब्रोन्कोएल्वियोलर पानी से धोना (बाल) प्रदर्शन का विश्लेषण करने के लिए. ट्रेकिआ और घेघा बेनकाब करने के लिए गर्दन के उदर भाग में मांसपेशियों कटौती; उन संरचनाओं के पार्श्व और पृष्ठीय पक्ष में चीरों बनाने के अलग करने के लिए.
- संदंश के साथ ट्रेकिआ उठा और सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + प्लस 1 मिमी EDTA बिना पीबीएस के 1 मिलीलीटर से भरा एक पतली टिप हस्तांतरण विंदुक शुरू करने की एक स्केलपेल के साथ एक छोटा सा चीरा बनाते हैं. पैदा होता है और कुल मात्रा कम से कम तीन बार aspirate; महाप्राण एक बाँझ 1.5 मिलीलीटर ट्यूब सेल निलंबन हस्तांतरण और बर्फ पर जगह और.
- पहले सही वेंट्रिकल में सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + प्लस 1 मिमी EDTA बिना पीबीएस के 5 एमएल इंजेक्शन द्वारा फेफड़ों छिड़कना, फेफड़ों पैरेन्काइमा में उपस्थित सेल आबादी का विश्लेषण करने के लिएदिल की.
नोट: यह फेफड़ों 'रक्त वाहिकाओं में मौजूद लाल रक्त कोशिकाओं और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के सबसे को समाप्त होगा. छिड़काव सही ढंग से प्रदर्शन किया गया था, तो फेफड़ों रंग सफेद गुलाबी से बदलाव होगा. - बाएं वेंट्रिकल के आधार से यह clamping द्वारा फेफड़ों से दिल को अलग और नाजुक पूरी तरह से इसे दूर करने के लिए कैंची से रक्त वाहिकाओं में कटौती. CRPMI या बहाव विश्लेषण के आधार पर न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक समाधान में उन्हें perfused फेफड़ों लो और जगह प्रदर्शन किया जाएगा.
- मांसल म्यूकोसा में सेल आबादी के विश्लेषण के लिए, पशु के सिर को अलग और यह कदम 3.2.1 में नहीं किया गया तो लार ग्रंथियों और आसन्न नरम ऊतक को हटा दें.
- जबड़ा संयुक्त तक पहुँचने तक मुंह के प्रत्येक पक्ष पर एक चीरा और पिंस विच्छेदन बोर्ड पर इसे ठीक उपयोग कर, मुंह से जीभ और फर्श के साथ एक साथ अवर जबड़ा अलग. जीभ खींच; एक स्केलपेल का उपयोग कर एक चीरा बनाने जहां बीएजीभ के एसई मांसल म्यूकोसा बेनकाब करने के लिए तीसरे molars तक पहुँचने तक मुंह से मंजिल मिलती है.
- पूरी तरह से जीभ निकालें; एक 0.5 मिमी बायोप्सी पंच ले और कम incisors के बगल में रखें. धीरे मुंह की मंजिल तक मांसल ऊतक और प्रेस के मसूड़ा प्रविष्टि से कट पूरी तरह बाहर कटौती की गई है.
- अब मांसल ऊतकों को हटाने को पूरा करने के लिए तीसरी दाढ़ के करीब बायोप्सी पंच रखकर एक बार और दोहराएँ. CRPMI या न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक युक्त एक स्वच्छ ट्यूब पर रखें.
FACS विश्लेषण के लिए 3.2) नमूना तैयार.
- 24 अच्छी तरह से थाली में प्रत्येक माउस से अलग 'फेफड़ों ऊतक स्थानांतरण और लगभग 2 मिमी के ऊतक के छोटे टुकड़े प्राप्त करने तक कैंची की एक साफ जोड़ी के साथ उन्हें कीमा. प्रकार द्वितीय Collagenase के 30 मिलीग्राम, FBS के बिना RPMI के 1 मिलीलीटर में 50 माइक्रोग्राम DNase मैं युक्त पाचन माध्यम के प्रति अच्छी तरह से 1 मिलीलीटर जोड़ें. ऊपर पिपेट और नीचे पांच बार और सेते37 डिग्री सेल्सियस और 5% से 40 मिनट के लिए सीओ 2.
- मांसल ऊतक में सेल आबादी के विश्लेषण के लिए, Dispase की 2 इकाइयों, RPMI के 1 मिलीलीटर में 30 मिलीग्राम प्रकार द्वितीय Collagenase, 50 माइक्रोग्राम DNase मैं युक्त एक साथ 3.2.1 में पाचन मध्यम स्थानापन्न. 50 rpm पर एक कक्षीय प्रकार के बरतन में 37 डिग्री सेल्सियस पर 20 मिनट के लिए पाचन माध्यम के 500 μl में एक माउस से एकत्र ऊतक सेते हैं.
- ऊष्मायन, पिपेट अप के बाद और ऊतक के सबसे बाधित कर दिया गया है 10 बार या 30 सेकंड अप करने के लिए जब तक नीचे. एक 40 माइक्रोन बाँझ सेल झरनी हालांकि सेल निलंबन फ़िल्टर और पीबीएस के 5 मिलीलीटर 5 मिमी EDTA के साथ पूरक से धो लें.
नोट: बाह्य मैट्रिक्स और रेशेदार ऊतकों की पूरी पाचन हासिल नहीं किया जाएगा. यह वृद्धि हुई है कोशिका मृत्यु और एफ के समग्र परिणाम को प्रभावित करने कोशिकी प्रोटीन के विनाश में परिणाम होगा हालांकि, बाद collagenase और / या dispase या आक्रामक विचूर्णन की उपस्थिति में अब ऊष्मायन बार सिफारिश नहीं कर रहेएसीएस विश्लेषण. - 400 XG, 5 मिनट, 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र.
- बाल में सेल आबादी के विश्लेषण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस, 400 XG, 5 मिनट में कोशिकाओं अपकेंद्रित्र और 3.2.4 कदम जारी है.
- लिम्फ नोड्स में सेल आबादी के विश्लेषण के लिए, एक बाँझ पेट्री डिश पर एक 70 माइक्रोन सेल झरनी जगह और झरनी में cRPMI के 1 मिलीलीटर के साथ लिम्फ नोड्स एक साथ डाल दिया. एक 2 मिलीलीटर बाँझ सिरिंज का फ़ैसला बाहर ले जाओ और झरनी के जाल के खिलाफ लिम्फ नोड्स को कुचलने के लिए एक मूसल के रूप में इसका इस्तेमाल करते हैं. ताजा cRPMI के 1 मिलीलीटर के साथ सेल झरनी कुल्ला और एक बाँझ ट्यूब पेट्री डिश से कोशिकाओं को हस्तांतरण.
- प्रत्येक नमूने के एक प्रतिनिधि विभाज्य लो और व्यवहार्य सेल नंबर निर्धारित करने Trypan ब्लू के साथ यह दाग.
- मिलीलीटर 2x10 7 कोशिकाओं / के निलंबन को बनाने और एक कोशिकामापी ट्यूब में 50 μl जोड़ने के लिए पीबीएस 5 मिमी EDTA-1% गोजातीय सीरम Albumin-: FACS-EDTA में कोशिकाओं Resuspend.
- Appr युक्त एक 2X एंटीबॉडी मिश्रण तैयारउपलब्ध FACS साधन के अनुसार सतह मार्कर और fluorochromes के खिलाफ एंटीबॉडी के opriate संयोजन. सेल निलंबन युक्त प्रत्येक ट्यूब में 2X एंटीबॉडी मिश्रण के 50 μl जोड़ें.
नोट: इष्टतम मात्रा निर्धारित करने के लिए प्रत्येक fluorochrome लेबल एंटीबॉडी टाइट्रेट संदर्भ 29 देखना एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए इस्तेमाल किया जा सके. - अंधेरे में बर्फ पर 30 मिनट सेते हैं.
- FACS-EDTA के 3 मिलीलीटर के साथ एक बार धोएं और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर centrifuging द्वारा कोशिकाओं नीचे स्पिन, एक ही बफर के 200 μl में कोशिकाओं resuspend और एक प्रवाह कोशिकामापी में विश्लेषण.
नोट: नमूनों की एक बड़ी संख्या को संभालने, तो ऊपर वर्णित FACS विश्लेषण के लिए धुंधला प्रोटोकॉल बजाय कोशिकामापी ट्यूबों के यू नीचे 96 अच्छी तरह प्लेटें में किया जा सकता है. हालांकि, 96 अच्छी तरह प्लेटें धोने चरणों का उपयोग अगर प्रत्येक washi के बीच 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 400 XG पर कोशिकाओं नीचे कताई यह 4 बार FACS-EDTA के लिए 200 μl जोड़ने और दोहरा द्वारा निष्पादित किया जाना चाहिएएनजी कदम. - इस बिंदु पर, कोशिकामापी बाद में (निर्धारण के बाद 72h तक) के प्रवाह में विश्लेषण के लिए नमूनों को ठीक.
- कोशिकाओं को ठीक करने के लिए, FACS-एंटीबॉडी के साथ लेबलिंग के बाद पीबीएस कोई सीए 2 + / 2 मिलीग्राम +, FBS के बिना 1 मिमी EDTA में कोशिकाओं को धोने. कोई सीए 2 + / 2 मिलीग्राम + एक ही बफर के 50 μl में कोशिकाओं को निलंबित और अतिपरासारी (2x) पीबीएस में एक नया तैयार 4% paraformaldehyde के समाधान के 50 μl जोड़ें.
- आरटी पर 20 मिनट के लिए सेते हैं और FACS-EDTA में 3 बार धोएं.
- 4 डिग्री सेल्सियस पर 200 FACS-EDTA के μl और दुकान में कोशिकाओं Resuspend और अप करने के लिए 72 घंटे के लिए प्रकाश से रक्षा की.
नोट: FSC-एसएससी निर्धारण से प्रभावित किया जा सकता है. मिलकर रंगों लगानेवाला एजेंटों की उपस्थिति में अपमानित किया जा सकता है क्योंकि फिक्सिंग यदि नमूने निर्माता के साथ fluorescently लेबल एंटीबॉडी की अनुकूलता की जांच. नमूने संक्रमित पशुओं से उत्पन्न अगर निर्धारण अत्यधिक जब analy कोई व्यवहार्य रोगजनकों उपस्थित रहेंगे यह सुनिश्चित करने के लिए सिफारिश की हैmicroaerosols नमूना के अधिग्रहण के दौरान उत्पन्न किया जा सकता क्योंकि FACS मशीन में नमूने गाते हैं.
4 कुल शाही सेना निकालना, सीडीएनए संश्लेषण और रीयल टाइम पीसीआर.
4.1) शाही सेना निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण.
- यांत्रिक विघटन से पसंद की न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक समाधान में ऊतक homogenize (जैसे, एक रोटर-स्टेटर homogenizer का उपयोग कर, ऊतक ruptor और मोती, आदि मिलाते हुए उच्च गति). 15 मिनट और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए 12,600 XG पर अपकेंद्रित्र ऊतक मलबे को हटाने के लिए. एक स्वच्छ ट्यूब स्थानांतरण सतह पर तैरनेवाला.
- निर्माता निर्देशों का पालन पसंद की विधि के साथ शाही सेना निकालें.
नोट: यह aliquots बनाने और -80 डिग्री सेल्सियस पर RNase मुक्त ट्यूब में उन्हें स्टोर, सीधे अलगाव के बाद इस्तेमाल किया जा करने के लिए नहीं जा रहा है अगर आरएनए, गिरावट के लिए अत्यधिक अतिसंवेदनशील है. दोहराया ठंड और विगलन से बचें. ट्यूब हर समय दस्ताने के साथ संभाला जाना चाहिए. एक नमूने विगलन के बादlways बर्फ पर उन्हें रखने के लिए. - 260 एनएम पर न्यूक्लिक एसिड की absorbance के उपाय और माइक्रोग्राम / μl में एकाग्रता की गणना.
- DNase मैं के अलावा द्वारा मिश्रण तैयार (1 नमूना के लिए): ultrapure पानी की 7.6 μl, 10X DNase मैं बफर के 1 μl, 0.4 DNase मैं (प्रवर्धन ग्रेड) शेयर 1 यू / μl के μl, और 8.4 μl जोड़ने DNase मैं कुल शाही सेना के 1 ग्राम से युक्त प्रत्येक नमूने के लिए मिश्रण.
- 1 माइक्रोग्राम / μl की एकाग्रता में शाही सेना का प्रयोग करें और एक टेम्पलेट के रूप में कुल शाही सेना के 1 μl जोड़कर retrotranscription प्रतिक्रिया (आरटी पीसीआर) प्रदर्शन करते हैं. नमूने भी पतला कर रहे हैं और एकाग्रता उम्मीद से कम है, तो कुल शाही सेना के बजाय पानी की बड़ी मात्रा में जोड़ें. फिनोल निशान आरटी पीसीआर की उपज प्रभावित हो सकता है, क्योंकि चुनाव के शाही सेना निकासी प्रोटोकॉल फिनोल के क्लोरोफॉर्म मिश्रण शामिल विशेष रूप से अगर आरएनए जोड़ते समय अंतिम प्रतिक्रिया मात्रा का 20% से अधिक नहीं है.
- 4 डिग्री सेल्सियस या मैं पर 10 मिनट के द्वारा पीछा आरटी पर 15 मिनट सेतेCE. (ऊष्मायन समय से अधिक मत !!)
- प्रत्येक ट्यूब EDTA 25 मिमी (आणविक जीव विज्ञान ग्रेड) की 1 μl जोड़ें और DNase मैं निष्क्रिय करने के लिए 10 मिनट के लिए 65 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं.
- (1 प्रतिक्रिया के लिए) के रूप में निम्नानुसार retrotranscription (आरटी) मिश्रण तैयार करें: 1 μl यादृच्छिक hexamer प्राइमरों शेयर 0.2 मिलीग्राम / एमएल, 1 μl dNTPs शेयर 10 मिमी, 4 μl 5X एम MLV आरटी बफर, 2 μl डीटीटी 0.1 एम, 1 μl RNase बाहर स्टॉक 40 यू / μl, और 1 μl एम MLV शेयर 200 यू / μl retrotranscriptase.
- आरटी पीसीआर की 10 μl 10 μl DNase मैं प्रतिक्रिया ट्यूब मिश्रण जोड़ें.
- निम्नलिखित कार्यक्रम के अनुसार एक थर्मल cycler में पीसीआर प्रतिक्रिया से बाहर ले जाने:
1X चक्र: 10 मिनट, 25 डिग्री सेल्सियस; 50 मिनट, 37 डिग्री सेल्सियस; 15 मिनट, 70 डिग्री सेल्सियस - Ultrapure पानी की 80 μl जोड़कर 5: सीडीएनए 1 पतला. -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर.
4.2) वास्तविक समय पीसीआर (qPCR).
- Taq डीएनए पी युक्त 5 μl मास्टर मिश्रण: (1 प्रतिक्रिया के लिए) के रूप में qPCR प्रतिक्रिया मिश्रण तैयारolymerase, SYBR ग्रीन डाई, पीसीआर बफर, dNTP मिश्रण और 2 MgCl (नीचे 4.2.2 देखें); कदम 4.1.10 में संकेत के रूप में आगे प्राइमर की एक 10 माइक्रोन स्टॉक समाधान के 0.9 μl, एक रिवर्स प्राइमर के 10 माइक्रोन स्टॉक समाधान, 1.2 μl ultrapure पानी की 0.9 μl, और सीडीएनए टेम्पलेट के 2 μl पहले पतला.
नोट: इस खंड में प्रयुक्त अभिकर्मक एकाग्रता और साइकिल प्रोटोकॉल, "सामग्री और अभिकर्मकों की तालिका" में वर्णित अभिकर्मकों और उपकरणों के साथ विशेष रूप से बाहर ले जाने के लिए अनुकूलित थे अन्य ब्रांडों इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन प्रतिक्रिया संस्करणों, अभिकर्मक एकाग्रता और साइकिल प्रोटोकॉल भिन्न हो सकते हैं. RT-qPCR प्रदर्शन से पहले अपने निर्माता निर्देश की जाँच करें. - निम्नानुसार qPCR साधन स्थापनाः
1X चक्र: 15 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस
40X चक्र: 15 सेकंड, (इस बिंदु अधिग्रहण प्रतिदीप्ति पर) 1 मिनट, 60 डिग्री सेल्सियस के द्वारा पीछा 95 डिग्री सेल्सियस.
नोट: mRNA की रिश्तेदार मात्रा का ठहराव के लिए सीटी विधि 30 एक referenc के अनुसारई जीन सीटी मूल्यों को सामान्य बनाने के लिए चयनित किया जाना चाहिए. चुनाव के संदर्भ जीन इसकी अभिव्यक्ति भिन्न हो सकते हैं के रूप में विशिष्ट परख परिस्थितियों में परीक्षण किया जाना चाहिए; Actb, GAPDH या 18S आमतौर पर संदर्भ के रूप में चयनित जीनों में से कुछ हैं. - दहलीज मूल्य सेट करें और डेटा का विश्लेषण.
Representative Results
Sublingual immunotherapy सफलतापूर्वक फेफड़ों 'प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. हम flagellin, TLR5 और NLRC4 एगोनिस्ट की एक खुराक, chemokines CXCL1, CCL20 और खारा इलाज नियंत्रण की तुलना साइटोकाइन आईएल -6 एन्कोडिंग mRNA की महत्वपूर्ण upregulation पैदा कर सकते हैं कि पता चला है. MRNA स्तर की प्रेरण भट्ठा के बाद 8 घंटे पर नुकीला गुना और 20 घंटा (चित्रा 1) के बाद बेसल स्तर पर लौटने. भट्ठा एस. निमोनिया के साथ 2 घंटे पूर्व intranasal संक्रमण प्रदर्शन किया गया था हालांकि, जब Cxcl1 और Il6 mRNA के स्तर में काफी गैर इलाज जानवरों (चित्रा 2) की तुलना में भट्ठा के बाद भी 24 घंटे upregulated रहे.
FACS द्वारा बाल में सेल आबादी और फेफड़े के ऊतकों का विश्लेषण मांसल मार्ग से Flic साथ इलाज जानवरों फेफड़ों 'ऊतक (चित्रा 3) में वायुमार्ग में neutrophils की संख्या में वृद्धि हुई है, लेकिन नहीं था कि पता चला.
चित्रा 4 में दिखाया गया है, flagellin साथ भट्ठा संरक्षण को बढ़ावा दिया और तीव्र न्यूमोकोकल निमोनिया के खिलाफ अस्तित्व में वृद्धि हुई.
Flagellin साथ sublingual immunotherapy के बाद चित्रा फेफड़ों 'ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफाइल की 1 काइनेटिक्स. आठ से 10 सप्ताह पुरानी BALB / ग चूहों (n = 4) संज्ञाहरण के तहत मांसल मार्ग द्वारा flagellin या खारा के 10 माइक्रोग्राम के साथ इलाज किया गया. फेफड़ों अलग समय बिंदुओं पर एकत्र और न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक में रखा गया था. कुल शाही सेना निष्कर्षण प्रदर्शन किया था और सीडीएनए संश्लेषित किया गया था. mRNA स्तर Tabl में सूचीबद्ध विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग वास्तविक समय पीसीआर द्वारा मूल्यांकन किया गयाई 1 सापेक्ष मात्रा का ठहराव सामान्य बनाने के लिए Actb mRNA स्तर का उपयोग ΔCt विधि अनुसार किया गया था. परिणाम ± SEM के मंझला के रूप में खारा इलाज समूह की तुलना में गुना वृद्धि के रूप में दिखाया जाता है. तारक मान व्हिटनी परीक्षण के अनुसार गणना सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद (पी <0.05) से संकेत मिलता है. परिणाम 2 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं.
साथ flagellin. आठ से 10 सप्ताह पुरानी BALB / ग चूहों (एन = 4 नियंत्रण समूह के लिए और एन = 7 इलाज समूह के लिए) sublingual immunotherapy के बाद न्यूमोकोकल निमोनिया के दौरान चित्रा 2 'फेफड़ों ट्रांसक्रिप्शनल प्रोफ़ाइल से flagellin या खारा के 10 माइक्रोग्राम के साथ इलाज किया गया संज्ञाहरण के तहत मांसल मार्ग. 2 घंटे बाद चूहों 10 के कारण कम से कम घातक खुराक (एमएलडी) के साथ intranasal मार्ग द्वारा चुनौती दी थीएस के नैदानिक अलग से 0% मृत्यु 4x10 5 CFU / 50 μl के लिए इसी निमोनिया सीरोटाइप 1 E1585,. फेफड़े चुनौती के बाद 24 घंटा एकत्र की है और शाही सेना निष्कर्षण और सीडीएनए संश्लेषण से बाहर किया गया जब तक न्यूक्लिक एसिड परिरक्षक में जमा थे. वास्तविक समय पीसीआर बाहर किया गया था (1 टेबल में प्राइमर सूची देखें) और रिश्तेदार मात्रा का ठहराव सामान्य बनाने के लिए Actb mRNA स्तर का उपयोग ΔCt विधि अनुसार किया गया था. परिणाम ± SEM के मंझला के रूप में खारा इलाज समूह की तुलना में गुना वृद्धि के रूप में दिखाया जाता है. तारक मान व्हिटनी परीक्षण के अनुसार गणना सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद (पी <0.05) से संकेत मिलता है.
Polymorphonuclear न्युट्रोफिल की चित्रा 3 विश्लेषण (PMN) भट्ठा के बाद फेफड़ों 'ऊतक और वायुमार्ग में भर्ती. आठ को10 सप्ताह पुरानी BALB / ग चूहों (n = 4) संज्ञाहरण के तहत मांसल मार्ग द्वारा flagellin या खारा के 10 माइक्रोग्राम के साथ इलाज किया गया. 2 घंटे बाद चूहों एस के एमएलडी साथ intranasal मार्ग द्वारा चुनौती दी थी निमोनिया सीरोटाइप 1 E1585. चुनौती के बाद 24 घंटा, बाल प्रदर्शन किया था और फेफड़ों FACS विश्लेषण के लिए प्रोसेस किया गया. PMN Ly6G उच्च / CD11b उच्च / CD11c नकारात्मक कोशिकाओं के रूप में पहचान की है और FCS-एसएससी प्रोफाइल पर आधारित थे. परिणाम बाल या फेफड़ों में कुल सेल नंबर के सम्मान के साथ PMN के प्रतिशत के रूप में व्यक्त कर रहे हैं. बार्स ± SEM के बीच का प्रतिनिधित्व करते हैं. तारों के एक तरह से मान व्हिटनी परीक्षण के अनुसार गणना सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद (पी <0.05) से संकेत मिलता है.
Flagellin साथ चित्रा 4 भट्ठा तीव्र न्यूमोकोकल निमोनिया के खिलाफ चूहों की रक्षा करता है. एस के एमएलडी साथ intranasal मार्ग द्वारा चुनौती दी थी निमोनिया सीरोटाइप 1 E1585. जीवन रक्षा के लिए एक दैनिक आधार पर मूल्यांकन किया गया था. कापलान-Meier घटता प्रवेश रैंक (मेंटल-कॉक्स) परीक्षण अनुसार तुलना में थे. तारों सांख्यिकीय महत्वपूर्ण मतभेद (पी <0.05) .Results 2 स्वतंत्र प्रयोगों के प्रतिनिधि हैं संकेत मिलता है.
| नाम | अनुक्रम 5'-3 ' | पीसीआर उत्पाद लंबाई (बीपी) |
| MB-actin_F | GCTTCTTTGCAGCTCCTTCGT | 68 |
| MB-actin_R | CGTCATCCATGGCGAACTG | |
| mCCL20_F | TTTTGGGATGGAATTGGACAC | 69 |
| mCCL20_R | TGCAGGTGAAGCCTTCAACC | |
| mCXCL1_F | CTTGGTTCAGAAAATTGTCCAAAA | 84 |
| mCXCL1_R | ACGGTGCCATCAGAGCAGTCT | |
| लाख 6_F | GTTCTCTGGGAAATCGTGGAAA | 78 |
| लाख 6_R | AAGTGCATCATCGTTGTTCATACA | |
| mTNFalpha_F | CATCTTCTCAAAATTCGAGTGACAA | 63 |
| mTNFalpha_R | CCTCCACTTGGTGGTTTGCT | |
| mCxcl2_F | CCCTCAACGGAAGAACCAAA | 72 |
| mCxcl2_R | CACATCAGGTACGATCCAGGC |
वास्तविक समय पीसीआर विश्लेषण के लिए इस्तेमाल तालिका 1 प्राइमर सूची. QPCR विश्लेषण के लिए इस्तेमाल विशिष्ट प्राइमर दृश्यों. फॉरवर्ड और माउस actb के लिए प्राइमरों, रिवर्स Cccl20, Cxcl1, Il6, Tnfa और Cxcl1 5'-3 'दृश्यों के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं और उम्मीद है और उत्पाद की लंबाई आधार जोड़े (बीपी) में संकेत दिया है.
Discussion
चिकित्सीय एजेंटों की sublingual प्रशासन श्वसन तंत्र में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना एक उपयोगी साधन के रूप में साबित किया गया है. सांस की शर्तों के उपचार के लिए भट्ठा का मुख्य लाभ यह intranasal प्रशासन 31 के आधार पर उपचार की तुलना में सुरक्षित किया जा रहा है, फेफड़े या नाक में यौगिकों के प्रत्यक्ष प्रसव को शामिल नहीं करता है.
Sublingual immunotherapy या तो एलर्जी सूजन और अस्थमा 32 के लक्षण उन्नति कर सकते हैं या जैसा कि यहाँ दिखाया गंभीर फेफड़ों में संक्रमण के इलाज के लिए सहज प्रतिरक्षा तंत्र की क्षणिक सक्रियण प्रेरित करने के लिए है कि विनियामक प्रतिक्रियाओं के शामिल होने के लिए, अलग अलग तरीकों से प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया मिलाना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस वीडियो में प्रस्तुत माउस मॉडल भट्ठा के लिए चिकित्सीय एजेंट के रूप में विभिन्न यौगिकों की जांच के लिए एक सुविधाजनक तरीका है.
इस पशु मॉडल प्रभाव को निर्धारित करने के लिए एक उपयोगी साधन प्रदान करता हैफेफड़ों 'प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के साथ ही अन्य अंगों (जैसे., लिम्फ नोड्स या बाहर का mucosal साइटों draining) में इन विट्रो मॉडल के उपयोग से मजाक उड़ाया नहीं किया जा सकता कि में भट्ठा की. Sublingual immunotherapy का उपयोग कर प्राप्त परिणामों का वर्णन है कि कई कागजात हालांकि वहाँ, मांसल प्रशासन की प्रक्रियाओं के लिए विस्तृत तरीके अभी तक उपलब्ध नहीं किया गया है. इसके अतिरिक्त, मॉडल श्वसन तंत्र में प्रणालीगत के साथ ही स्थानीय संरक्षण प्रदान करने का लक्ष्य मांसल टीके के मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
साथ वीडियो में दिखाया गया है, यौगिकों के मांसल प्रशासन आसानी से गहन प्रशिक्षण की आवश्यकता के बिना किया जा सकता है कि एक साधारण प्रक्रिया है. आमतौर पर, पशुओं के प्रबंध में कुशल एक व्यक्ति इस प्रोटोकॉल में वर्णित के रूप में इंजेक्शन anesthetics का उपयोग कर 10 चूहों के एक समूह में भट्ठा प्रदर्शन करने के लिए 1 घंटे की आवश्यकता होगी. न्यूमोकोकल चुनौती के रूप में अच्छी तरह से किया जाता है, तो 90 अतिरिक्त मिनट तैयार करने के लिए आवश्यक हो जाएगाजीवाणु निलंबन और जानवरों की intranasal चुनौती प्रदर्शन करते हैं.
यहाँ प्रस्तुत FACS प्रोटोकॉल फेफड़ों 'सेल गतिशीलता पर लिम्फ नोड्स के साथ ही उनके प्रभाव draining, प्रशासन के स्थानीय स्थल पर भट्ठा के प्रभाव की सुविधाजनक लक्षण वर्णन अनुमति देते हैं.
ब्रोन्कोएल्वियोलर सामग्री और फेफड़ों पैरेन्काइमा की अलग विश्लेषण एयरवेज के प्रतिरक्षा निवासी और ऊतक के भीतर रहते हैं कि उन से सेल प्रकार घुसपैठ भेदभाव के लिए महत्वपूर्ण है. बाल सामग्री के विश्लेषण से वायुकोशीय मैक्रोफेज कारोबार के अध्ययन के साथ ही विभिन्न उपचार द्वारा प्रेरित वायुकोशीय रिक्त स्थान, उदा., PMNs, इयोस्नोफिल्स, monocytes में कोशिकाओं भर्ती की गतिशीलता की अनुमति देता है. बाल भी एंजाइम से जुड़ी immunosorbent परख (एलिसा) या मांसल टीकाकरण के बाद हासिल स्रावित IgA एंटीबॉडी का पता लगाने के द्वारा स्रावित साइटोकिन्स और chemokines की उपस्थिति का आकलन किया जा सकता है. फेफड़ों 'के ऊतकों का अध्ययनअन्य प्रकार की कोशिकाओं, प्रतिष्ठित वृक्ष के समान कोशिकाओं, टी कोशिकाओं और बी कोशिकाओं के लक्षण वर्णन अनुमति देगा.
FACS विश्लेषण के लिए बाल के नमूने और लिम्फ नोड्स की तैयारी सरल है. नमूना संग्रह के बाद, सामान्य रूप से 60 मिनट में 10-20 नमूने के लिए धुंधला प्रोटोकॉल पूरा करना आवश्यक है. बाह्य मैट्रिक्स के पाचन के लिए आवश्यक है, क्योंकि इसके विपरीत, फेफड़ों या मांसल ऊतक से कोशिकाओं का अलगाव और अधिक समय की आवश्यकता होगी. मांसल मार्ग द्वारा दिया चिकित्सीय एजेंट के अवशोषण vivo इमेजिंग सिस्टम में उपयोग कर fluorescently या radioactively लेबल अणुओं की ट्रैकिंग से संबोधित किया जा सकता है.
Sublingual immunotherapy प्रभावी रूप से प्रतिरक्षा श्वसन तंत्र में प्रतिक्रियाओं के रूप में अच्छी तरह से इलाज या सांस की शर्तों को रोकने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रणालीबद्ध प्रेरित करने के लिए एक आकर्षक तरीका है. भट्ठा मैं के बाद श्वसन तंत्र में प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की सहनशीलता बनाम सक्रियण का निर्धारण तंत्र की व्याख्याविभिन्न सांस की शर्तों के खिलाफ उपलब्ध उपचार के साथ अकेले या संयोजन में इस्तेमाल किया जा सकता है कि नए चिकित्सीय रणनीतियों का तर्कसंगत डिजाइन की अनुमति के लिए महत्वपूर्ण है.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine solution (50 mg/ml) | Pharma Service, Uruguay | ||
| Xilacine solution (2 %) | Portinco S.A., Uruguay | ||
| Sterile 1 ml syringe | Modern, Uruguay | ||
| Sterile 27 G needle | Modern, Uruguay | ||
| RPMI 1640 | General Electric Health Care | E15885 | |
| Fetal Bovine Serum | ATCC | 302020 | |
| Penicillin/Streptomycin Solution | SIGMA | P4333 | |
| Sterile PBS without Ca2+/Mg2+ | PAA | H21002 | |
| Type-I Collagenase | Life Technologies/Gibco | 17100017 | |
| Deoxyribonuclease I (DNAse-I) | SIGMA | D4513 | |
| Dispase | Life Technologies/Gibco | 17105041 | |
| PerCP-Cy5.5 conjugated rat anti mouse IgG2b anti CD11b | BD | 550993 | Clone M1/70 |
| APC conjugated hamster anti mouse IgG1 anti CD11c | BD | 550261 | Clone HL3 |
| APC-Cy7 conjugated rat anti mouse IgG2a anti Ly6G | BD | 560600 | Clone 1A8 |
| Sterile Saline Solution | Laboratorio Farmaco Uruguayo, Uruguay | ||
| Tryptic Soy Agar | BD Difco, France | 236950 | |
| Defibrinated Sheep Blood | Biokey, Uruguay | ||
| Sterile Petri Dishes | Greiner | 633180 | |
| p10 Pipette | Gilson | F144802 | |
| p20 Pipette | Eppendorf | 3120000097 | |
| p200 Pipette | Gilson | F123601 | |
| p200 Pipette | Capp | C200 | |
| p200 Pipette | Eppendorf | 3120000054 | |
| p1000 Pipette | Eppendorf | 3120000062 | |
| Sterile Filter Tips p10 | Greiner | 771288 | |
| Sterile Filter Tips p200 | Greiner | 739288 | |
| Sterile Filter Tips p1000 | Greiner | 750288 | |
| Vortex | BIOSAN | V1-plus | |
| Stainless steel fine tip forceps | SIGMA | Z168785/Z168777 | Curved and straight |
| Dressing tissue forceps | SIGMA | F4392 | Length 8 inches |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4017 | Straight |
| Micro-dissecting forceps | SIGMA | F4142 | Curved |
| Mayo Scissors | SIGMA | Z265993 | |
| Scalpel | SAKIRA MEDICAL | ||
| Sterile Biopsy Punch Ø 3mm | Stiefel Laboratories Ltd. | 2079D | 5 mm diameter can also be used |
| Sterile 1.5 ml Tubes | Deltalab | 200400P | |
| Sterile 15 ml Tubes | Greiner | 188271 | |
| Sterile 50 ml Tubes | Greiner | 227261 | |
| Sterile serological pipettes 5 ml | Greiner | 606160 | |
| Sterile serological pipettes 10 ml | Greiner | 607160 | |
| Sterile serological pipettes 25 ml | Greiner | 760180 | |
| Biological safety cabinet, class II | Thermo Scientific | 1300 series, type A2 | |
| Micro-Isolator Rack | RAIR IsoSystem | 76144W | Super Mouse 1800 AllerZone |
| Refrigerated Microcentrifuge | Eppendorf | Legend Micro 21R | |
| Microcentrifuge | Heraeus | Biofuge-pico | |
| Centrifuge | Thermo Scientific | Sorval ST40R | |
| CO2 Incubator | Thermo Scientific | Model 3111 | |
| Sterile Thin-tip pasteur pipettes | Deltalab | D210022 | |
| Sterile pasteur pipettes | Deltalab | 200007 | |
| Sterile 24-well plate | Greiner | 662160 | |
| Trypan Blue Solution | Life Technologies | T10282 | |
| Automatic Cell Counter - Countess | Life Technologies | C10227 | |
| Countess Cell Counting Chamber Slides | Life Technologies | C10312 | |
| Flow Cytometry Tubes | BD | 343675 | |
| Flow Cytometer - FACS Canto-II | BD | ||
| Real Time PCR Instrument - Rotor Gene Q or ABI 7900 | Qiagen / Applied Biosystems | ||
| Trizol Reagent | Life Technologies | 15596-026 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I | Life Technologies | 18068-015 | Molecular Biology Grade |
| DNAse-I Buffer 10X | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| EDTA 25 mM | Life Technologies | 18068015 | Molecular Biology Grade |
| Ultra-Pure Water | Life Technologies | 10977 | Molecular Biology Grade |
| RNAse Out | Life Technologies | 100000840 | Molecular Biology Grade |
| Random Hexamer Primers | Life Technologies | N8080127 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT buffer | Life Technologies | 18057-018 | Molecular Biology Grade |
| M-MLV-RT enzime | Life Technologies | 28025-021 | Molecular Biology Grade |
| QuantiTect Syber Green PCR Kit | Qiagen | 204143 | Molecular Biology Grade |
| Specific primers | Life Technologies | Molecular Biology Grade |
References
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