A protocol is developed to examine the effects of an epigenetic drug DZNep on the development, fecundity and survivorship of mosquitoes. Here we describe procedures for the aqueous exposure of DZNep to immature mosquitoes and a blood-based exposure of DZNep to adult mosquitoes in addition to measuring SAH hydrolase inhibition.
Insektizidresistenz stellt ein großes Problem für die Malariakontrollprogrammen. Mücken Anpassung an eine Vielzahl von Veränderungen in der Umwelt schnell, so dass die Malaria unter Kontrolle eine allgegenwärtige Problem in tropischen Ländern. Die Entstehung von resistenten Populationen Insektizid garantiert die Erforschung von neuartigen Arzneimittelziel Wege und Verbindungen für Vektor-Moskito-Kontrolle. Epigenetische Medikamente werden auch in der Krebsforschung etabliert, aber nicht viel über deren Auswirkungen auf Insekten bekannt. Diese Studie liefert ein einfaches Protokoll für die Prüfung der toxikologischen Wirkungen von 3-Deazaneplanocin A (DZNep), eine experimentelle zugelassene epigenetische Arzneimittel zur Krebstherapie, in der Malaria-Vektor, Anopheles gambiae. Eine konzentrationsabhängigen Anstieg der Sterblichkeit und Abnahme der Größe wurde in unreifen Moskitos zu DZNep ausgesetzt beobachtet, während die Verbindung reduziert die Fruchtbarkeit der erwachsenen Mücken in Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Darüber hinaus gab es eine drogenabhängige Abnahme der S -Adenosylhomocystein (SAH) Hydrolaseaktivität in Mücken nach Exposition gegenüber DZNep Bezug auf Behandlungen zu kontrollieren. Diese Protokolle stellen die Forscher mit einer einfachen, Schritt-für-Schritt-Verfahren, um mehrere toxikologische Endpunkte für ein experimentelles Medikament zu beurteilen und wiederum zeigen eine einzigartige mehrgliedrige Ansatz für Ausflüge in die toxikologischen Wirkungen von wasserlöslichen epigenetische Arzneimittel oder Verbindungen Interesse gegen vector Mücken und andere Insekten.
Malaria ist für die höchste Anzahl von Insekten verursachten Todesfälle in der Welt verantwortlich. Schätzungsweise 219 Millionen Fälle treten jährlich weltweit, was zu etwa 660.000 Todesfällen, vor allem in Afrika ein. Trotz aller gemeinsamen Bemühungen, Malaria Programme mehrere Herausforderungen. Während insektizide behandelten Moskitonetzen und Innenrest Spritzen bilden wichtige Komponenten des Programms, Resistenz gegen Insektizide in der lokalen Bevölkerung behindern diese Bemühungen 2. Die rasche Zunahme der Insektizide resistent Mückenpopulationen weitgehend auf die Fähigkeit der Malariamücken, schnell auf Veränderungen in ihrer Umgebung anpassen und nutzen unterschiedliche Nischen 3,4,5 zugeschrieben. Um die bestehenden Mechanismen der Insektizid-Resistenz zu überwinden, ist die Erforschung von neuartigen Insektizid Ziele und nächste Generation Verbindungen gewährleistet. Eine einfache, Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Bestimmung der Wirksamkeit von experimentellen Insektizide auf die verschiedenen Entwicklungsstadien der Malaria-mosquitoes erheblich verbessern würde diese Bemühungen.
Pharmakologische Untersuchungen der Wirkung von Medikamenten auf Zelllinien und Tiermodellen haben die Verwendung von epigenetischen Medikamenten als ein nützliches Werkzeug zur Modulation der Genetik und Physiologie von Zellen und Organismen hergestellt. DNA-Methylierung und Histon-Modifikation gibt zwei epigenetische Mechanismen, die die Genexpression in vielzelligen Organismen beeinflussen, ohne die zugrunde liegenden DNA-Sequenz 6. Post-translationale Modifikationen wie Methylierung spielen eine entscheidende Rolle bei der Aufrechterhaltung der Zellintegrität und Genexpression und kann einige grundlegende Prozesse 7,8,9 beeinflussen. Forschung in einigen Insektenarten haben die Bedeutung der Epigenetik in Verfahren, die Oogenese hervorgehoben und Erhaltung von Stammzellen 10 sowie Dosiskompensation 11. Jedoch werden solche Aspekte der Krankheitsvektoren noch erforscht werden. Verwendung einer Verbindung, dieses System in Mücken modulieren, können Sie uns mit in liefernSehenswürdigkeiten in der neuen Insektizid Zielpfade. 3-Deazaneplanocin A (DZNep) ist eine bekannte Histonmethylierung Inhibitor, der Auswirkungen auf die verschiedenen Arten von Krebs wurden untersucht 12,13,14,15,16. DZNep ist ein stabiles wasserlösliches Arzneimittel, das epigenetische indirekt hemmt Histon Lysin N-methyltransferase (EZH2), eine Komponente der Polycomb repressive Komplex 2 (PRC2) in Säugerzellen. PRC2 spielt eine wichtige Rolle bei der Regulierung des Wachstums von Stammzellen in multizellulären Organismen und Histon-Methylierung ist ein Schlüsselaspekt der PRC2 vermittelte Gen-Silencing. Bei immungeschwächten Mäusen Zellen mit DZNep vorbehandelt wurde gezeigt, dass weniger tumorerzeugende 17 zu sein. Dieses Medikament wird immer für die Untersuchung anderer Krankheiten, wie zum Beispiel nicht-alkoholische Fettleber, in der EZH2 beteiligt ist 18 verwendet. DZNep ist ein etablierter S -adenosylhomocysteine (SAH) Hydrolaseinhibitors 19, 20. Die Hemmung der SAH-Hydrolase-Ergebnisse in eineAkkumulation von SAH und wiederum führt zur Hemmung der Methyltransferase-Aktivität durch die Begrenzung des verfügbaren methyl Donorgruppen. SAH ein Aminosäurederivat durch Organismen wie Insekten, in ihren Stoffwechselwege verwendet. Eine neue Studie hat gezeigt, dass DZNep in niedrigen Dosen können Diapause beeinflussen und verzögern die Entwicklung von Insekten 21 gezeigt.
Hier wird ein robustes Verfahren, um die Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung von verschiedenen Lebensstadien von Moskitos zu untersuchen wird entwickelt. Die drei Teile des Protokolls enthalten Anweisungen für die Prüfung der Auswirkungen einer wasserlöslichen Verbindung auf unreifen Moskitos, Erwachsenen Blut-Fütterung Frauen, und die Enzymaktivität der erwachsenen männlichen und weiblichen Mücken. Zuerst wird DZNep in Wasser gelöst, um unreifen Moskitos Entwicklung und das Überleben zu studieren. Dies wird in zwei Konzentrationen durchgeführt, um alle Unterschiede, die sich aus 10-fachen Anstieg der Wirkstoffexposition zu vergleichen. Um die Wirkung des Medikaments auf erwachsene weibliche Mücken, DZNep erkundenauf defibrilliert Schafblut hinzugefügt und das Blut künstlich zu Frauen geleitet. Anschließend wird das Ergebnis des Medikaments auf Fruchtbarkeit sucht. Schließlich wird ein Test der enzymatischen Aktivität unter Verwendung von 5,5'-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (DTNB) als Indikator, um den Effekt auf DZNep SAH Hydrolase Hemmung in erwachsene männliche und weibliche Mücken bestimmen. Während dieses Protokoll mit einem Malaria-Mücke, Anopheles gambiae entwickelt, kann es leicht zur Untersuchung der Wirkungen von Verbindungen der Zinsen auf Stechmückenarten oder andere Insekten angepasst werden. Die in diesem Protokoll aufgeführten Techniken können nicht effizient auf ein Arzneimittel mit begrenzter oder keiner Löslichkeit in Wasser oder wäßrigen Medien angewendet werden.
Es gibt mehrere Schritte für die erfolgreiche Anwendung dieses Protokolls. Für die Larventest sollte darauf geachtet werden, um korrekt zu kennzeichnen und zu replizieren jede Testkonzentration werden. Randomisierung von Proben und das Hinzufügen der benannten Menge des Arzneimittels an die jeweiligen Testbrunnen ist ein wichtiger Teil dieser Versuchsanordnung. Vor der Zugabe der 2. Larvenstadium von Moskitolarven in eine 96-Well-Mikroplatte, kann jede Larve auf einem Papiertuch für 2-3 sec gesetzt, um ü…
The authors have nothing to disclose.
We thank Victor Marquez for providing DZNep.HCl and Scotty Bolling for manufacturing the bloodfeeders. The Mopti and SUA2La strains of An. gambiae were obtained from the Malaria Research and Reference Reagent Resource Center (MR4). This work was supported by the Fralin Life Science Institute and the grant from National Institutes of Health 1R21AI094289 to Igor V. Sharakhov.
Name of the Reagent/Equipment | Company | Catalgue Number | Comments |
96-well microplate | Fisher Scientific | 12565561 | |
Cell culture plate | CytoOne | CC7682-7506 | |
Centrifuge | Sorvall Fresco | 76003758 | A different centrifuge can be used |
Colored tape rolls | Fisher | S68134 | |
Dissection microscope | Olympus | SZ | |
DTNB | Sigma Aldrich | D8130 | |
DZNep.HCl | Sigma Aldrich | SMLO305 | |
Egg dish cups | |||
Filter papers | Fisher | 09-795E | |
Glass feeders | Virginia Tech | ||
Glass tissue homogenizer | |||
Heating element | Fisher Scientific | NC0520091 | |
Incubator | Percival scientific | I36VLC8 | A different incubator can be used |
Microcentrifuge tube, 2 ml | Axygen | 22-283 | |
Microcentrifuge tube, 1.5 ml | Axygen | MCT-150-C | |
Micropipette | Eppendorf | 4910 000.069 | |
Na2HPO4 | Fisher Scientific | M-3154 | |
NaH2PO4 | Fisher Scientific | M-8643 | |
pH meter | Mettler Toledo 7easy | S20 | |
Plate reader | Spectramax | M2 | |
SAH | Sigma Aldrich | A9384 | store at -20C |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T8787 |