Abstract
Inherente processen van Drosophila pupal ontwikkeling kan verschuiven en vervormen het oog epitheel op manieren die individuele cel gedrag moeilijk te volgen tijdens live cell imaging maken. Deze werkwijzen omvatten: retinale rotatie celgroei en organismale beweging. Bovendien onregelmatigheden in de topologie van het epitheel, waaronder subtiele stoten en plooien vaak voorgesteld als de pop wordt voorbereid voor beeldvorming, maakt het moeilijk om in-focus afbeeldingen van meer dan enkele ommatidia verwerven één brandvlak. De workflow hier geschetste remedies deze kwesties, zodat u gemakkelijk de analyse van cellulaire processen tijdens Drosophila ontwikkeling pupal oog. Toepasselijk-gefaseerde poppen zijn opgesteld in een beeldvormend toestel dat gemakkelijk kan worden gemonteerd in de meeste laboratoria Ubiquitin-DE-Cadherin. GFP en GMR-GAL4 driven UAS-α-catenine: GFP gebruikt om celgrenzen visualiseren in het oog epitheel 1 -3. Na deconvolutie istoegepast op fluorescerende beelden die zijn vastgelegd op meerdere brandpuntsvlakken, zijn maximale projectie beelden gegenereerd voor elk tijdstip en verbeterde software voor fotobewerking. Alignment algoritmen worden gebruikt om snel stabiliseren overbodige beweging, waardoor individuele cel gedrag gemakkelijker te sporen.
Introduction
De verbinding Drosophila oog wordt gekenmerkt door de stereotiepe opstelling van de ~ 750 ommatidia gescheiden door een honingraat-rooster accessoire pigmentcellen 4,5. Deze pigment cellen worden gevormd door een gecoördineerde combinatie van gebeurtenissen: de lokale cel bewegingen, celgroei, veranderingen in cel vorm, en apoptose. Live-weergave van deze epitheel maakt het mogelijk om de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan deze gebeurtenissen in een fysiologisch relevante en onverstoord driedimensionale context te bestuderen.
In tegenstelling tot eerdere protocollen 6,7, de techniek geschetste bevat een efficiënte methode voor het stabiliseren van vreemde weefsels beweging die niet losgekoppeld van het belichtingsproces kan worden. Deze werkwijze verhoogt studies cel gedrag in de ontwikkeling Drosophila popstadium oog epitheel - een weefsel dat groeit, roteert en verplaatst de loop van beeldvorming. Naast de motion-stabilisatietechniek dehier beschreven zal nuttig zijn voor het bestuderen van cellen in andere contexten waarin vreemde beweging optreedt.
Om celgrenzen visualiseren het netvlies gebied Drosophila, werden transgene vliegen lijnen gegenereerd die expressie Ubi-DE-Cadherin: GFP en UAS-α-catenine: GFP onder controle van de oog-specifieke driver GMR-GAL4 1-3. Het gebruik van twee GFP-gelabeld membraan markers maakt de visualisatie van celgrenzen lagere lichtintensiteit. Dit minimaliseert weefselschade en fotobleking bij herhaalde blootstelling aan hoge-energie-golflengtes, waardoor hogere framerate en film duur. Om de effectiviteit van RNAi transgenen, UAS-DCR-2 werd ook verwerkt in een tweede vlieg lijn 8 te verbeteren.
In een derde update eerdere protocollen wordt een eenvoudiger beeldvormend toestel dat gemakkelijk wordt gemonteerd in de meeste laboratoria beschreven. Dit apparaat voorkomt de eis om een gespecialiseerde beeldvorming r hebbenig gegenereerd door een universiteit 'werkplaats' of een soortgelijke dienst. Deze beeldvorming rig is vergelijkbaar met die gebruikt worden om het andere pupal weefsels 9,10.
Hier voorgesteld is een eenvoudig live cell imaging protocol dat kan worden gebruikt om het morfogenetische gebeurtenissen die bijdragen aan oog patroonvorming van ~ 17-42 uur na verpopping formatie (hr APF) direct beoordelen. Specifiek, dit protocol laat toe de gevolgen van het modificeren genexpressie tijdens popstadium ontwikkeling bepalen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Figuur 3 toont een overzicht van de experimentele procedure.
1. Tissue Voorbereiding
- Om de gevolgen van gewijzigde expressie van een gen van interesse, het opzetten van de volgende kruis in tweevoud te bepalen en bij 25 ° C te houden: UAS-transgen (mannetjes) X GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b (maagdelijke vrouwtjes) OPMERKING: Om de controle weefselkruisreactiviteit UAS-lacZ- verkrijgen mannetjes aan GMR-GAL4; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP vrouwtjes. β-galactosidase produceert geen defecten in cel gedrag in de retina.
- Om de effectiviteit van RNAi transgenen verbeteren, kruis UAS-RNAi mannetjes aan GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b maagdelijke vrouwtjes.
OPMERKING: Incidenteel defecten in cel gedrag retina ectopische expressie Dcr-2 waargenomen (gegevens niet getoond). Waakzaamheid is aan te bevelen bij gebruik van deze aanpak. - Select witte pre-poppen van geschikte genotypen en plaats in 1,5 ml microcentrifugebuisjes. Als de poppen te uiten DCR-2 selecteert u mannelijk of vrouwelijk poppen: uitdrukking van UAS-DCR-2, een insert op het X-chromosoom, is sterker bij mannen. Poppen worden gesekst op 0 uur APF voor pigmentatie van het popstadium - de gonaden van mannetjes zichtbaar grote doorschijnende bollen aan de zijkanten van de pop (ongeveer een derde van de posterior).
- Incubeer microcentrifugebuisjes met poppen, in een schone plastic tip-doos bij 25 ° C. Om uitdroging te voorkomen van poppen plaats een 10 cm 2 stukje weefsel, gedrenkt in gedestilleerd water, in de punt-doos.
OPMERKING: als de luchtvochtigheid in de punt-doos te hoog wordt het popstadium geval kan drassig en moeilijk te ontleden in de volgende stappen te worden. - Incubeer gedurende juiste moment. Naar cel gedrag geassocieerd met patroonvorming het oog vast te leggen, poppen voor de beeldvorming te bereiden op rond 17 uur APF, 20 uur APF of 24 hr APF. Zie Representatieve resultaten voor verdere discussie over wanneer specifieke cel gedrag het best worden waargenomen.
- Leg een stuk verse dubbelzijdige tape op een zwarte Sylgard dissectie schotel. Plaats een pop, dorsale zijde naar boven, met het hoofd van de pop gehandeld op grond van de dubbelzijdige tape (figuur 1A) .Probeer niet aan de thoracale en abdominale regio's van de pop houden aan de dubbelzijdige tape. Met een pincet voorzichtig op te tillen en verwijder de operculum de pupal hoofd bloot. Scheur langs de kant van de pupal zaak naar het gebied rond één oog bloot.
- Verwijder voorzichtig de pop van het plakband. Als de pop blijft aanhanger, breng een kleine hoeveelheid gedestilleerd water tot aan de kruising tussen de pupal zaak en tape om de hechting te verzwakken.
2. Montage
- Teken een kleine 15 mm2 lijst van vloeipapier en slaat een gat in de middlethat 5,5 mm in diameter (figuur 1B). Onderdompelen in gedestilleerd water en plaats inhet centrum van een microscoopglaasje. Met behulp van een 30 cc spuit, knijp erin om een uniforme ring vaseline aan het vloeipapier kader omringen. Zorg ervoor dat de vaseline ring marginaal hoger is dan de breedte van de pop en dat de diameter van de ring fractie kleiner is dan de breedte van een dekglas.
- Voeg een kleine kraal van vaseline direct op de glijbaan, in het gat geslagen in het vloeipapier (figuur 1C) .Carefully regelen de pop, op zijn kant, ondersteund door de vaseline kraal (figuur 1D).
- Plaats een dekglaasje bovenop de vaseline ring zodat deze de epitheel boven het oog neuroepithelium (figuur 1D). Zachtjes te comprimeren de voorbereiding op het dekglaasje tegen de vaseline verzegelen en het genereren van een kleine platte contactoppervlak tussen de pupal oog regio en het dekglaasje.
3. Fluorescentie Imaging
- Afbeelding de pupal voorbereiding met behulp van eenfluorescentiemicroscoop. Elke 7 min capture seriecoupes door het apicale gebied van het oog neuro-epitheel, in het gebied van de contactplaatsen.
LET OP: a) Passende seriecoupes zijn meestal 4-5 per z-stack bestaat uit 0,2 micrometer z-stappen. b) Onregelmatigheden in de topologie van het epitheel, waaronder lichte stoten en vouwen, kan het een uitdaging om in-focus afbeeldingen van grote weefselgebieden te verkrijgen. Terwijl de beeldvorming, kan een deel van een gebied van belang te vinden te zijn in-focus, en een naburige regio om out-of-focus. Inclusief een kleine druppel gedestilleerd water tussen het popstadium oog en dekglaasje kan een aantal acute weefsel plooien maar niet weg licht ongelijke topologie kenmerk van de vroege stadia van popstadium oog morfogenese. In deze gevallen oversample het weefsel door de uitbreiding van de z-stack tot in-focus plakjes worden verworven voor het gehele gebied. c) Het vastleggen seriecoupes elke 7 min moet levend-imaging voor 3 tot 4 uur mogelijk te maken zonder een significante reductie in de intensiteit van GFP fluorescentie dat de beeldkwaliteit in gevaar kan brengen. Kortere intervallen kan de totale tijd van de beeldvorming te verminderen. - Verder beeldvorming voor 3 tot 4 uur. Heeft een automatische scherpstelling en tijdfunctie die op veel fluorescerende microscopen niet gebruiken omdat popstadium groei en pompen van de hemolymfe verplaatst de positie van het netvlies en waakzaam heroriëntatie nodig elke 14-21 min. NOTA VAN dat beeldvorming dan 4 uur kan vertragen of kraam morfogenese van het oog.
- Gebruik geschikte deconvolutie software om de achtergrond te verminderen en het contrast van de seriële sectie afbeeldingen. Voor elke z-stack-bestand, voert u de volgende in LAS AF software (zie tabel van Materialen): Ga naar het deelvenster Gereedschappen, selecteert u 3D Deconvolutie en klik op Toepassen.
- Genereer afbeelding een maximale uitval (MP) voor elke deconvoluted stack bestand: Navigeer naar het deelvenster Gereedschappen, selecteer 3D-projectie en klik op Toepassen.
Opmerking: De maximale projectie algoritme kan niet aan een uniform te genererenafbeelding ly in-focus voor weefsel dat is overbemonsterde. Een techniek voor het slijpen van out-of-focus regio's wordt beschreven in stap 5.2.
4. Post-beeldvorming Pupal Rescue en Fenotype Verification
- Aan te pakken of artefacten werden ingevoerd of de pop geschaad tijdens de beeldvorming, verwijder voorzichtig de pop uit de beeldvorming rig: met behulp van een tang verwijder het dekglaasje en breng de pop aan een schoon flesje van voedsel. Bewaren bij kamertemperatuur of 25 ° C, totdat de volwassen vlieg tevoorschijn.
- Zorgvuldig onderzoeken het fenotype van de volwassen oog en te vergelijken met de ogen van volwassen vliegen die uit de oorspronkelijke vlieg kruis.
5. Beeldverwerking
- Automatic Image Alignment:
OPMERKING: De live Drosophila weefsel zal verschuiven en te groeien in de hele beeldvorming proces. Bijgevolg centra afbeeldingen verzamelden op opeenvolgende tijdstippen mogelijk niet overeen met hetzelfde punt in de Drosophila weefsel. Ook degehele netvlies roteert ongeveer 30 ° tussen ~ 21 en 23 uur APF. Om individuele cel gedrag te benadrukken en afleiding veroorzaakt door organismaal groei te verminderen, uitlijnen elk MP image.While dit kan handmatig worden uitgevoerd, de beeldbewerkingssoftware hier gebruikt (zie tabel van Materialen) heeft ingebouwde algoritmen die het proces kunnen versnellen.- Vanaf het tabblad Bestand van het hoofdmenu geopend Scripts en selecteer Bestanden laden naar stapel.
- Importeer de MP-beeldbestanden in het paneel Load Lagen en selecteer OK. Zorg ervoor dat de poging om Bronafbeeldingen optie automatisch uit te lijnen niet is geselecteerd.
OPMERKING: Als deze optie is geselecteerd, kan de software een uitlijningsalgoritme dat de beeldgegevens vervormt gebruiken. - Zodra alle MP-bestanden in het deelvenster Lagen hebt geladen, zorg ervoor dat alle beelden zijn in chronologische volgorde, zodanig dat het vroegste tijdstip is aan de bovenkant van de laag stack. Als de lagen zijn niet in de juiste volgorde, slepen en neerzetten, totdat ze worden besteldcorrect.
- Kies Lagen automatisch uitlijnen van het tabblad Bewerken van het hoofdmenu. Kies herpositioneren en klik op OK.
- Als de Auto-Align algoritme niet in slaagt de frames oriënteren op een relevante brandpunt, kleine aanpassingen met behulp van het gereedschap Verplaatsen.
- Composiet Slijpen:
OPMERKING: Out-of-focus gebieden van een afbeelding initiële MP kunnen geslepen worden door "gewassen" de overeenkomstige deconvoluted stack in LAS AF software. Bijsnijden een stapel bestand kan men het interval van een z-stack die wordt onderworpen aan de maximale projectie algoritme handmatig beperken.- Zoek de Crop functie in het deelvenster Gereedschappen (onder het tabblad Proces). Handmatig beperken de eerste en laatste plakjes zodanig dat ze overspannen alleen de hechting riem binnen de aanvankelijk out-of-focus regio. Apply een nieuwe stapel bestand dat is geoptimaliseerd voor deze streek genereren.
- Genereer een nieuwe maximale uitval voor de lokaal geoptimaliseerd stack en export als een TIFF-bestand.
- In the beeldbewerkingssoftware (zie tabel van Materialen), open Scripts (gelegen in het tabblad Bestand van het hoofdmenu) en selecteer Bestanden laden naar stapel.
- Importeer de eerste afbeelding MP-bestand en lokaal geoptimaliseerd MP-bestand voor een bepaald tijdstip in het paneel Load Lagen en selecteer OK. Zorg ervoor dat de poging om Bronafbeeldingen optie automatisch uit te lijnen niet is geselecteerd.
- Selecteer beide lagen in het Lagen deelvenster en kies vervolgens Lagen automatisch overvloeien (gelegen in het tabblad Bewerken van het hoofdmenu) naar de juiste regio's van de twee beelden automatisch te maskeren, waardoor een gelijkmatig in-focussen retinale veld. Sla deze afbeelding composiet als TIFF-bestand.
- Herhaal de stappen 5.2.1 tot 5.2.5 voor alle suboptimale MP beelden.
- Verdere aanpassingen: draaien, bijsnijden en aanpassen van de niveaus van de Movie Lagen:
- Met alle lagen geselecteerd, gebruikt u de tool Transform (Bewerken> Vrije transformatie) om de afbeeldingen te roteren zodat de dorsale-ventrale as van het netvlies is uitgelijndde y-as van het filmbeeld.
- Indien nodig, gebruik maken van de Crop tool om het gezichtsveld te reduceren tot een gewenste grootte en vorm.
- Gebruik niveau-aanpassing (van de afzonderlijke frames) ter verbetering van het contrast tussen de celmembraan en de cel lichaam.
- Voor stilistische doeleinden en om specifieke cel gedrag te benadrukken, introduceren valse kleur aan bezienswaardigheden in elk frame te markeren.
- Animatie: Zet de afbeeldingen in een film:
- Open het deelvenster Animatie van het tabblad Windows van het hoofdmenu. Selecteer Maak Frames van Lagen van het menu in de rechterbovenhoek van het deelvenster Animatie.
- Merk op dat de lagen worden toegevoegd in het animatie in volgorde beginnend vanaf de bodem van de stapel. Als u de volgorde van de frames te keren, alle frames selecteren en dan kunnen selecteren Reverse Frames van het deelvenster Animatie menu.
- Selecteer een kader vertragingstijd voor elk frame met behulp van de dropdown menu onder het frame duimnagel.
LET OP: Het frame vertraging Movies 1-4 in dit document is 0,8 sec. - Vanaf het tabblad Bestand van het hoofdmenu geopend Exporteren en selecteer Video renderen. Kies QuickTime Export onder Bestand op Opties en selecteer een gewenste videoformaat. Onder Render Opties instellen Frame Rate op Aangepast, voer een beeldsnelheid van 15, en klik Render.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Live beeldvorming van het popstadium oog een succesvolle strategie cel gedragingen die bijdragen tot patroonvorming van de neuroepithelium observeren. De rol van specifieke eiwitten kunnen gemakkelijk worden beoordeeld door expressie transgenen die eiwitgehalte wijzigen tijdens de ontwikkeling oog. Om dit GMR-GAL4- doen wordt gebruikt om transgene expressie rijden achter de morfogenetische groove. Dit biedt het voordeel van niet te verstoren eerdere gebeurtenissen die het veld oog te vestigen tijdens de eerste twee larvale stadia. Naast vele RNAi transgenen vereisen veel tijd om effectief te verminderen eiwitgehaltes (data nu getoond). Vandaar rijden RNAi transgenen met de GMR-GAL4 driver lijn maakt vaak derde larvale ontwikkeling oog larvestadium en eversie van het oog schijven tijdens metamorfose om verder te gaan zonder kleerscheuren en vermindert significant eiwitgehaltes pas later, tijdens pupal oog morfogenese. Als de larvale ontwikkeling echter wordt verstoord door een zeer efficiënte RNAi transgen, vliegen kruisen kanworden gehandhaafd op 18 ° C om transgenexpressie en poppen overgebracht naar 25 ° C bij 0 uur APF verminderen. Om de effectiviteit van RNAi transgenexpressie, transcript of eiwitniveaus adres moet worden beoordeeld in-fase aangepaste poppen met standaardtechnieken (bijvoorbeeld kwantitatieve PCR, immunofluorescentie, immunoblotting).
Tijdens larvale ontwikkeling worden de fotoreceptor kernen van elk ommatidium aangesteld als een golf die reist van het posterieur voorste zijde van het oog schijf 11. Deze ontwikkelings gradiënt werd behouden in het popstadium oog. Inderdaad, als afgebeeld op 22,5 uur APF, patroonvorming van GMR-GAL4, UAS-DCR-2; UAS-α-cat: GFP, Ubi-DE-Cad: GFP; + / SM5-TM6b retina was aanmerkelijk rijpen in het achterste gebied (Figuur 2). Het fenotype van deze retina was vergelijkbaar met die van wildtype stammen fly (gegevens niet getoond). Traditioneel pupal oog morfogenese wordt beschreven volgens de ontwikkelingstijd (bvhr APF). Echter, vanwege de uitgesproken ontwikkelingsstoornissen gradiënt stellen wij voor het beschrijven oog patronen op basis van de volgende evenementen:
1 ° het verpakken (figuur 2 en Film 1): In eerste instantie maar liefst acht cellen direct contact op met de fotoreceptoren bundels. Twee cellen - meestal de voorste en achterste cellen - werden aangeworven als voorverkiezingen (1 ° s). Deze 1s snel omcirkelde de fotoreceptor bundels elkaar verbinden stabiele verbindingen vormen. Ongedifferentieerde interommatidial cellen (IC's) lag in een ongeorganiseerde manier tussen elke ommatidial groepering. Gelijktijdig met 1 ° cel werving, apoptose gesnoeid ongeveer 5% van de IC zwembad zoals eerder beschreven (niet geannoteerde in Film 1) 12.
IC intercalation (figuur 2 en Movie 2): Zoals de 1 ° s verpakt en verzegeld over elk photoreceptor bundel, lokale cell bewegingen reorganiseerde de IC's gegroepeerd op de dorsale en ventrale zijden van elke ommatidium. De IC's geintercaleerd van meerdere (meestal twee) rijen in een enkele rij. De positie van het doel van het verplaatsen van IC's kunnen vertrouwen worden voorspeld in wild-type weefsel door het observeren van de directionele projectie van grote 'cellulaire extensies'. De groei van de 1 ° cellen gevoegd en droeg waarschijnlijk IC intercalatie 13. Veel ICs zal gaan om differentiëren secundaire cellen (2 ° s) (niet getoond).
3 ° concurrentie (figuur 2 en Movie 3): Na intercalation, drie IC's streden om de tertiaire (3 °) niche te bezetten. In deze dynamische strijd, cellen bezet vaak de 3 ° niche voor zo weinig als 5 tot 10 minuten alvorens te worden verplaatst. Uiteindelijk een enkele cel opgericht een stabiele 3 ° niche.
Definitieve snoeien (figuur 2 en Movie 4): Een golf van apoptose 3,15-18 verminderde het aantal IC's tot het vereiste minimum om efficiënt genereren van een nette zeshoekige IC rooster over het samengestelde oog 5,14: drie 3 ° s en zes 2 ° s rond elke ommatidium. Zoals eerder opgemerkt, gewoonlijk die overtollige ICs liggen het dichtst bij de borstelharen werden geëlimineerd door apoptose 7. We waargenomen celdood gelijktijdig met IC intercalatie en 3 ° niche inrichting en stellen snoeien van overtollige cellen bijgedragen aan de efficiëntie van deze gebeurtenissen. Daarnaast werd subtiele herpositionering van borstelhaar organules vaak waargenomen IC werden gesnoeid.
Figuur 1:. Pupal dissectie en beeldvorming (A) Het operculum wordt verwijderd uit een Drosophila pop (hier bij 23 uur APF) aan de kop van een blootnimal. Stippellijn een stukje dubbelzijdige tape. (B) Illustratie van de eenvoudige live imaging rig. (C en D) met hoofd blootgesteld, wordt de pop geplaatst op ongeveer 35 ° rustend op de vaseline kraal. (D) afbeelding hogere vergroting van een pop geplaatst boven op de vaseline kraal. De positie van het dekglaasje en objectief worden geïllustreerd (niet op schaal). Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Een helling van ontwikkeling over de hele pupal oog. (A) Een enkel beeld van een pupal oog afgebeeld op 22,5 uur APF. Adherens kruispunten zijn gelabeld door DE-Cad: GFP en αCat: GFP. Boxed regio wordt geannoteerd in (C). (B) van de mid-stage en volledig patroon ommatidia, Illustraties op 24 en 41 uur APF respectievelijk. Twee 1 ° s (blauw) omringen een centrale groepering van vier conus cellen (wit). Met 41 hr APF de patroonvorming van interommatidial cellen (lichtgrijs) is compleet: drie 3 ° s bezetten alternatieve hoekpunten en een enkele 2 ° vormen elke kant van de zeshoek. Drie varkenshaar organules (donkergrijs) omgeven iedere ommatidium. (C) Annotatie van een klein gebied van het oog (van A). Twee 1 ° cellen (voorbeelden pseudo-gekleurd licht blauw) uit te breiden naar elke photoreceptor bundel omringen. IC's (groen, geel, rood en donkerblauw) intercaleren in enkele rijen. Bij elk alternatief hoekpunt drie cellen concurreren (geschetst in roze) op de 3 ° niche (oranje gekleurd) bezetten. Zie Films 1-4 om deze gebeurtenissen te observeren ontvouwen. Klik hier om een grotere versie van deze figur bekijkene.
Figuur 3:. Samenvatting van de experimentele procedure Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Film 1 :. Primaire verpakking 1 ° cellen gekozen uit de pool van cellen rondom elke beginnende ommatidium. Als twee 1 ° s omringen elke ommatidium en sluit, adherens kruispunten snel te vormen (roze lijnen). De rechte 1 °: 1 ° cel contacten uitbreiden en 1 ° s beginnen te groeien, isolerende photoreceptor bundels uit de omliggende IC's. Aanvankelijk was de fotoreceptoren gloeien helder, dichte GFP markering uitgebreide adherens kruispunten. Morfologische veranderingen gratweevoudig trekken deze photoreceptor knooppunten onder het vlak van beeldvorming en X-vormige verbindingen tussen elke set van vier apicale kegel cellen boven elkaar ommatidium duidelijker geworden. Originele beelden op de linker; pseudo-kleuring en annotaties geïntroduceerd in panelen op rechts. Eye afgebeeld vanaf 21 uur APF.
Movie 2 :. Interommatidial cel intercalaction De interommatidial cellen (IC) in het rood, blauw, geel en groen in eerste instantie vormen een kwadrant scheiden van een dorsale (boven) en ventrale (onder) ommatidium door een afstand van twee cellen. De rode en gele ICs strekken dorsaal respectievelijk (bij t = 42 min) ventraal en maakt contact met doel 1 ° en 56 min. De blauwe en groene IC's op dezelfde manier verlengen tot tegenovergestelde ommatidium richten. 'Nieuw' 1 °: IC kruispunten snel uit te breiden lateraal. Op 112 min de oorspronkelijke kwadrant van IC's heeft volledig ingelast om generate een enkele rij cellen. Originele beelden op de linker; pseudo-kleuring en annotaties geïntroduceerd in panelen op rechts. Eye afgebeeld vanaf 23 uur APF.
Film 3 :. Tertiaire concurrentie Op alternatieve hoekpunten twee of drie cellen (geschetst in roze) strijden om de 3 ° niche te bezetten. Lijkt te 'duwen' hun buren opzij, cellen genereren van grote extensies die te bereiken in de richting tegenover ommatidia. Het bezetten van de 3 ° niche (oranje gekleurd) is vaak vluchtig en cellen ofwel trekken of uit positie worden geduwd door hun buren. Aan het einde van deze 217 min film vele 3 ° niches lijken vastgesteld. Originele beelden op de linker; pseudo-kleuring en annotaties geïntroduceerd in panelen op rechts. Eye afgebeeld vanaf 23 uur APF.
Movie 4. Final snoeien cellen in de nabijheid van borstelhaar organules verwijderd door apoptose. Voorbeelden worden in paars, rood, geel en blauw. Gedurende beeldvorming, verwijdering van cellen liet slechts een 2 ° langs elke horizontale arm van de IC zeshoek. Snoeien van overtollige cellen op de diagonaal zijden van de IC zeshoek werd niet meegenomen in deze film. In dit genotype kleine fouten in de plaatsing van borstelhaar groepen werden vaak waargenomen (vergelijk figuur 2B). Twee van de drie haren groepen gemanoeuvreerd hoek niches tijdens de beeldvorming: herpositionering leek te worden vergemakkelijkt door het verwijderen en de beweging van de naburige IC's. Originele beelden op de linker; pseudo-kleuring en annotaties geïntroduceerd in panelen op rechts. Eye afgebeeld vanaf 26 uur APF.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De beschrijving van wild-type ontwikkeling (hierboven) vormt de basis voor vergelijkingen van patroonvorming gebeurtenissen in RNAi of overexpressie genotypen. Vergelijkingen van live-ontwikkeling weefsel zijn van onschatbare waarde bij het nauwkeurig bepalen welke cel gedrag wordt gereguleerd door een eiwit van belang. Verder, en niet hier beschreven, live cell imaging maakt het mogelijk om kwalitatieve en / of kwantitatieve beschrijving van de functie van een gen van interesse maken de gebeurtenissen die patroon het oog. Van 30-32 uur APF meeste pigmentcellen stabiele posities hebben verworven en apoptose heeft overtollige cellen gesnoeid uit het netvlies veld. Daarna worden alleen subtiele veranderingen waargenomen als de pigment cellen hun karakteristieke vormen aannemen: de 3 ° s hexagonale worden en, zoals 1 ° s subtiel breiden, de breedte van de aangrenzende rechthoekige 2 ° cellen afneemt. Volgende generatie van pigment en lens materiaal waarschijnlijk belemmert succesvolle beeldvorming van adherens kruispunten.
Hoewel een valuable strategie, moet een aantal valkuilen te worden gehouden bij de beeldvorming van de live-pupal oog. Ten eerste, het verwijderen van de voorste pupal geval maakt het dier bijzonder kwetsbaar voor uitdroging, oververhitting, en verwondingen tijdens montage en beeldvorming. Beledigingen zoals deze kunnen gegevens te beschamen door het induceren van atypische weefsel ontwikkeling, dat is niet om het genotype in onderzoek relevant. Ten tweede, de hier beschreven protocol vereist dat een glazen dekglaasje maken direct contact met het popstadium kop epitheel. We hebben geconstateerd dat het netvlies ontwikkeling kramen als overmatige druk wordt uitgeoefend bij het duwen van de dekglaasje tegen het oog. Inderdaad exogene mechanische krachten hebben in andere systemen is aangetoond dat ontwikkelingsprocessen beïnvloeden waaronder weefselarchitectuur 19,20. Daarom is het belangrijk om zeer plaats voorzichtig het dekglaasje tegen het oog. Bovendien moet afgebeeld poppen worden gered uit de beeldvorming tuigage en liet te voorschijn als volwassenen: artefacten geïntroduceerd tijdens de beeldvorming kanVaak worden gedetecteerd door het vergelijken van de afgebeelde oog van deze volwassenen met de ogen van vergelijkbare leeftijd vliegt van de oorspronkelijke kruising. Verder moet gegevens van meerdere beeldvorming sessies worden vergeleken cel gedrag controleren. Tenslotte moet standaard immunofluorescentie worden bepaald of de inrichting, grootte en het aantal cellen in-fase aangepaste weefsel hetzelfde.
Ectopische DCR-2 wordt vaak gebruikt om de effectiviteit van RNAi verbeteren. Echter in aanwezigheid van ectopische DCR-2, IC intercalatie, stabilisatie van de 3 ° niche en apoptose werden soms onderbroken (gegevens niet getoond). Zo DCR-2 expressie moet met voorzichtigheid worden gebruikt.
De hier beschreven protocol maakt gebruik van GFP naar label adherens kruispunten en beoordelen morfogenese van pigmentcellen in de pupal oog. Deze strategie kan eenvoudig worden aangepast voor andere doeleinden (bijv fotoreceptor morfogenese beoordelen). Voor een double-labeling aanpak, extra UAS transgenen dat andere cellulaire componenten van belang (bijvoorbeeld secretaresse blaasjes, endoplasmatisch reticulum, nucleus) met niet-GFP-tags labelen zou kunnen worden opgenomen. Maar de intensiteit en de levensduur van deze transgenen zullen worden doorgelicht: RFP, DsRed en mCherry bijvoorbeeld gebleken slechte labels voor beeldvorming van het popstadium oog voor langdurig moeten pigmentcel patronen vast te leggen (gegevens niet getoond). Als onderzoeken snelle cel gedrag (bv secretie) de hier beschreven protocol kan gemakkelijk worden aangepast voor confocale microscopie van geschikte fluorescente proteïnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| UAS-dcr-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b | Available on request from authors | ||
| Scotch double stick tape | 3M | 665 | |
| Black Sylgard dissection dish | Fill glass petri dish to rim with Sylgard (colored black with finely-ground charcoal powder) or Sylgard 170; leave at room temperature for 24-48 hr to polymerize | ||
| Sylgard | Dow Corning | SYLG184 | |
| Sylgard (Black) | Dow Corning | SYLG170 | |
| Glass petri dish | Corning | 7220-85 | |
| 25 x 75 x 1 mm glass microscope slide | Fisher Scientific | 12-550-413 | |
| 22 x 40 mm glass coverslip | VWR | 48393-172 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Whatman 3mm Chromatography Paper | Fisher Scientific | 05-713-336 | |
| Vaseline | Fisher Scientific | 19-086-291 | Or purchase at local pharmacy. |
| 30 ml syringe | Fisher Scientific | S7510-30 | |
| Leica TCS SP5 DM microscope | Leica Microsystems | ||
| LAS AF Version 2.6.0.7266 microscope software | Leica Microsystems |
References
- Oda, H., Tsukita, S. Real-time imaging of cell-cell adherens junctions reveals that Drosophila mesoderm invagination begins with two phases of apical constriction of cells. J. Cell. Sci. 114, 493-501 (2001).
- Oda, H., Tsukita, S. Dynamic features of adherens junctions during Drosophila embryonic epithelial morphogenesis revealed by a Dalpha-catenin-GFP fusion protein. Dev. Genes Evol. 209, 218-225 (1999).
- Freeman, M. Reiterative use of the EGF receptor triggers differentiation of all cell types in the Drosophila eye. Cell. 87, 651-660 (1996).
- Cagan, R. Cell fate specification in the developing Drosophila. retina. Dev Suppl. , 19 (1993).
- Bate, M., Arias, A. M. Pattern formation in the Drosophila. retina. The Development of Drosophila melanogaster. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor. 1277-1325 (1993).
- Larson, D. E., Liberman, Z., Cagan, R. L. Cellular behavior in the developing. Drosophila pupal retina. Mech. Dev. 125, 223-234 (2008).
- Monserrate, J. P., Brachmann, C. B. Identification of the death zone: a spatially restricted region for programmed cell death that sculpts the fly eye. Cell Death Differ. 14, 209-217 (2007).
- Lee, Y. S., et al. Distinct roles for Drosophila Dicer-1 and Dicer-2 in the siRNA/miRNA silencing pathways. Cell. 117, 69-81 (2004).
- Zitserman, D., Roegiers, F. Live-cell imaging of sensory organ precursor cells in intact Drosophila pupae. J. Vis. Exp. (51), 2706 (2011).
- Classen, A. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis. Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).
- Sato, M., Suzuki, T., Nakai, Y. Waves of differentiation in the fly visual system. Dev. Biol. 380, 1-11 (2013).
- Cordero, J., Jassim, O., Bao, S., Cagan, R. A role for wingless in an early pupal cell death event that contributes to patterning the Drosophila eye. Mech. Dev. 121, 1523-1530 (2004).
- Larson, D. E., Johnson, R. I., Swat, M., Cordero, J. B., Glazier, J. A., Cagan, R. L. Computer simulation of cellular patterning within the Drosophila pupal eye. PLoS Comput. Biol. 6, e1000841 (2010).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. The emergence of order in the Drosophila pupal retina. Dev. Biol. 136, 346-362 (1989).
- Cagan, R. L., Ready, D. F. Notch is required for successive cell decisions in the developing Drosophila retina. Genes Dev. 1099, 1112 (1989).
- Miller, D. T., Cagan, R. L. Local induction of patterning and programmed cell death in the developing Drosophila retina. Development. 125, 2327-2335 (1998).
- Sawamoto, K., Okano, H., Kobayakawa, Y., Hayashi, S., Mikoshiba, K., Tanimura, T. The function of argos in regulating cell fate decisions during Drosophila eye and wing vein development. Dev. Biol. 164, 267-276 (1994).
- Yu, S. Y., et al. A pathway of signals regulating effector and initiator caspases in the developing Drosophila eye. Development. 129, 3269-3278 (2002).
- Liu, Z., et al. Mechanical tugging force regulates the size of cell-cell junctions. Proc. Natl. Acad. Sci. 107, 9944-9949 (2010).
- Miyake, Y., Inoue, N., Nishimura, K., Kinoshita, N., Hosoya, H., Yonemura, S. Actomyosin tension is required for correct recruitment of adherens junction components and zonula occludens formation. Exp. Cell Res. 312, 1637-1650 (2006).
