Summary
هنا، نقدم بروتوكول لتحويل الكتان باستخدام الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار وتراجع. هذا البروتوكول هو بسيط لأداء وغير مكلفة، ولكن ينتج معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.
Abstract
الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو أسلوب يستخدم على نطاق واسع في مجال تحول النبات وتم الإبلاغ عن أن تكون ناجحة للعديد من الأنواع النباتية. ومع ذلك، لم يتم الإبلاغ الكتان (LINUM usitatissimum) التحول من الأزهار وتراجع. والهدف من هذا البروتوكول هو لإثبات أن الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وفعالة، والأهم من ذلك، يعطي معدل التحول أعلى من الأساليب المتاحة حاليا للتحول الكتان.
وباختصار، فقد انخفض النورات من الكتان في حل من الأجرعية تحمل البلازميد ثنائي الموجه (جزء T-DNA بالإضافة إلى إدراج تسلسل LINUM، LIS-1) ل1 - 2 دقيقة. كانت قد وضعت النباتات شقة على جانبهم لمدة 24 ساعة. ثم، تم الحفاظ على النباتات في ظل ظروف النمو الطبيعي حتى علاج المقبلة. بروسسوتكررت الصورة من غمس 2-3 مرات، مع ما يقرب من 10-14 فترات اليوم بين غمس. تم جمع بذور T1 ونبتت على تربة. بعد ما يقرب من أسبوعين، تم اختبار السلالات تعامل من قبل PCR المباشر؛ واستخدمت 3 الأوراق للنبات بالإضافة إلى الاشعال T-DNA المناسبة - 2. تم اختيار transformants إيجابية ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. وكان معدل التحول عالية بشكل غير متوقع، مع 50 - 60٪ من البذور من النباتات المعاملة يجري transformants إيجابية. هذا هو معدل التحول أعلى من تلك التي ذكرت لthaliana نبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى، وذلك باستخدام التحول الأزهار وتراجع. بل هو أيضا أعلى، والتي تم الإبلاغ حتى الآن، للتحول الكتان باستخدام طرق أخرى للتحول.
Introduction
الكتان (LINUM usitatissimum) هو المحصول المهم نمت على نطاق واسع للألياف والزيوت. التحول من الجينوم الكتان هو ممكن مع تقنيات مثل إصابة أو عدوى الأجرعية، وشارك في زراعة في زراعة الأنسجة، وتطبيق الجسيمات biolistic أو صوتنة الموجات فوق الصوتية تليها التجدد. ومع ذلك، هذه التقنيات لها عيوب كثيرة، بما في ذلك الميل إلى العديد من الأحداث طفرية وتمديد الوقت للحصول على خطوط المعدلة وراثيا. يمكن أيضا أن تكون بعض من هذه الطرق مكلفة وتتطلب معالجة المهرة وكفاءة الصكوك، مما أدى إلى انتعاش الشتلات منخفضة. الأهم من ذلك، هذه التقنية غالبا ما يؤدي إلى انخفاض معدلات التحول 2،6.
الأجرعية بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو نهج بسيطة وفعالة لتوليد النباتات المعدلة وراثيا. تم بشكل روتيني وبنجاح استخدامه للعديد من الأنواع النباتية مثل نبات الأرابيدوبسيس thalianعلى 1،4، فصة برميلية 11، الطماطم 12، 13 القمح والذرة 10. ومع ذلك، لم يعتقد أنه من كتقنية قابلة للتحول الكتان بسبب عدة عوامل، مثل انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، عدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، وحجم البذور واسع، ومعطف سميك، والتي يمكن أيضا أن يكون مشكلة لمثل هذه عملية التحول الوراثية. بالإضافة إلى ذلك، والجزء اختيار تقنية الأزهار وتراجع يتطلب الإنبات بذور حولت على وسائل الاعلام النباتات التي تحتوي على مضاد حيوي، مع السلالات تحولت حاليا على أساس قدرتها على الإنبات والبقاء الأخضر، في حين أن السلالات غير حولت إما لا تنبت أو تنبت ولكن التبييض بسرعة ويموت. في الأدب الحالي، وقد لوحظ أن من النوع البري الكتان يميل إلى الهروب تركيز عال من الاختيارات للمضادات الحيوية، وإنتاج نتائج إيجابية كاذبة، وجعل اختيار السلالات T1 مقرهاعلى مقاومة المضادات الحيوية أكثر صعوبة 6،14. أيضا، عندما أضيف على نسبة عالية من المضادات الحيوية إلى وسيلة الاختيار، ومعدل التحول الملحوظ انخفض بشكل كبير 9.
في هذا البروتوكول، استخدمنا الأجرعية وطريقة الأزهار وتراجع لتحويل خط من ألياف الكتان، ستورمونت المعلاق (استجابة والبلاستيك)، وهو ما ثبت للرد على الضغوط في البيئة عن طريق تغيير الجينوم 3،5. للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية، اخترنا أن تفعل اختبار PCR المباشر من الحمض النووي من أوراق T1، بدلا من اختيار طريق إضافة المضادات الحيوية إلى وسائل الإعلام النبات. ونحن قد استفادت من تشريح بسيط من الكتان لتتبع الزهور محددة في وقت العلاج. يسمح هذا النظام تتبع اختيار البذور من الزهور محددة والإنبات في التربة دون إضافة المضادات الحيوية. وقد تم تحديد transformants إيجابية ببساطة عن طريق اختبار DNA الحصول عليها من الأوراق باستخدام طريقة سريعة وفعالة سو PCR المباشر. وتظهر نتائجنا أن طريقة الأزهار وتراجع عملت بشكل جيد جدا في هذا الخط من الكتان ونتج من المستغرب في معدل التحول عالية جدا (50 - 60٪)، وهي نسبة أعلى من تلك التي لوحظت من قبل لthaliana نبات الأرابيدوبسيس، الذي تشير التقارير إلى أن 0،1-1 ٪ 1، وأعلى أيضا من الأنواع النباتية الأخرى 10،12. نحن أيضا اختبار صنف آخر من بذر الكتان (الكتان النفط)، بيتون (مستقر وغير مستجيبة)، وتشير البيانات الأولية لدينا أن الأزهار وتراجع يعمل أيضا لهذا التنوع من الكتان.
والهدف من هذا البروتوكول هو إظهار أن الأجرعية والأزهار وتراجع يمكن استخدامها لتوليد الكتان المعدلة وراثيا. وتبين لنا أن هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة، وأسرع من غيرها من أساليب التحول الكتان. والأهم من ذلك أنه يؤدي إلى معدل التحول أعلى بكثير من غيرها من أساليب التحول الكتان 2،6. تشريح نبات الأرابيدوبسيس thaliana، التي لديها العديد من الفروع والزهور، يا أماهKES من الصعب التمييز تراجع والزهور غير مغموسة على نفس النبات. لذلك، فإن أعدادا كبيرة من البذور، وحوالي 20،000 البذور للنبات، تحتاج إلى فحص لتحديد transformants إيجابية 8. الكتان، من ناحية أخرى، لديها عدد أقل من الفروع (فرع رئيسي واحد وعدد قليل من فروع جانبية) وعدد أقل من الزهور، وتنتج ما يقرب من 100 البذور في النباتات، مما يجعل من الممكن لتتبع الزهور الفردية واختيار البذور محددة خلال عملية الفرز.
ونقترح أن الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق لتحويل أي نوع من الأنواع ذات الصلة من الكتان، وهو جنس من حوالي 200 نوع. هذه الطريقة يعطي أعلى بكثير معدل التحول من الأساليب الأخرى للتحول الكتان. نحن نقترح أيضا أن فحص PCR المباشر من T1 ورقة DNA هو وسيلة فعالة للتغلب على مشكلة هروب المضادات الحيوية المقاومة التي غالبا ما تنتج العديد من ايجابيات كاذبة. فحص PCR المباشر يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس ر يقتصرس الكتان. تقنية تتبع البذور بسيطة العاملين في هذا البروتوكول يمكن تطبيقها على أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى مع المتفرعة التشريح مماثلة لالكتان.
Protocol
1. إنماء النباتات
- 6 أسابيع قبل غمس، وملء 5 بوصة الأواني مع التربة وزرع بذور الكتان ¼ بوصة في عمق التربة (4 البذور في وعاء). مما لا شك فيه أن يرسخ التربة على البذور. ري النباتات بانتظام والمحافظة عليها في وضح النهار الطويل (النور 14 ساعة و 10 ساعة الظلام).
- تحقق النباتات بانتظام لالنورات الأولية (مجموعات من أجهزة الزهور '). النباتات جاهزة للتحول عندما براعم مرئية ولقد شكلت فقط في الإزهار (الشكل 1 و 2). لرؤية البراعم، وقطع الأوراق من حوله إذا لزم الأمر.
ملاحظة: استخدام أفضل مرحلة زهرة أمر بالغ الأهمية وهو مفصل في مناقشة.- استخدام الفرع الرئيسي للمصنع لمعالجة التجريبية كما أنها تنتج المزيد من الزهور من الرياحات الجانب. استخدام فروع جانبية إما الضوابط (وينبغي عدم تراجع) أو لعلاجات تجريبية أخرى.
- بدلا من ذلك، استخدم الفروع الرئيسية والجانبية للنفس النبات لعلاج التجريبية ويستخدم مصنع آخر كعنصر تحكم أو لعلاجات تجريبية أخرى. استخدام تسميات للاحتفال فروع الفردية والزهور الفردية مع التاريخ ونوع من العلاج.
2. الاستنساخ والتحول في لالإشريكية القولونية (E. القولونية) خلايا
- استنساخ جزء / الجينات في المصالح في موقع استنساخ متعددة من متجه ثنائي محطة إيواء-DNA T.
- أداء الاستنساخ في خطوة واحدة أو خطوتين.
- استنساخ مباشرة إدراج صغيرة في هذا البروتوكول (~ 500 بي بي) في ناقلات ثنائي النبات. في هذا البروتوكول، واستخدام ناقلات ثنائي النبات (PRI909). خلاف ذلك، استخدام أي ناقلات النباتية الأخرى الثنائية في استراتيجية مماثلة.
- بدلا من ذلك، استنساخ إدراج كبيرة (≥6.5 كيلوبايت) في خطوتين: أولا باستخدام مجموعة استنساخ التجارية العامة (وليس زرع محددة)، ثم subclone في ناقلات ثنائي النبات.
- أداء الاستنساخ في خطوة واحدة أو خطوتين.
- انشاء REAC PCRنشوئها لتضخيم هذا الجين من الفائدة. تصميم الاشعال مع مواقع التقييد في نهاية 5 '(وفقا لموقع الاستنساخ متعددة من متجه ثنائي مصنع في الاستخدام).
- إجراء PCR قياسي باستخدام الحمض النووي الجيني الكتان مع الظروف الدراجات التالية: عنبر الأولي من 24 ° C، ثم 2 دقيقة في 94 ° C، تليها 30 دورات من 98 درجة مئوية لمدة 5 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 72 ° C لمدة 2 دقيقة. أداء خطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يعقبه عقد إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية.
- المنتجات PCR منفصلتين في 1٪ تريس / البورات / EDTA (TBE) agarose هلام، تشغيل هلام في 100 V لمدة 1 ساعة. تنقية المنتجات من هلام وقياس عن طريق معمل NanoDrop.
- إعداد مزيج ربط لاستنساخ المنتج PCR في استنساخ ناقلات التجاري. اتبع بروتوكول الشركة الصانعة.
- تحويل المزيج إلى ربط المختصة كيميائيا E. خلايا القولونية على النحو التالي.
- إضافة 2 ميكرولتر من مزيج ربط في قنينة واحدة من الفصلالمختص emically E. خلايا القولونية. احتضان على الجليد لمدة 30 دقيقة.
- حرارة صدمة الخلايا لمدة 30 ثانية في 42 درجة مئوية (حرارة صدمة الوقت ودرجة الحرارة يعتمد على نوع من الخلايا المستخدمة).
- احتضان على الجليد وإضافة 250 ميكرولتر من RT مرق السوبر الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) متوسطة.
- غطاء الأنبوب واحتضان في شاكر المداري في 200 دورة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة.
- نشر 10-50 ميكرولتر من كل تحول على لوحة prewarmed LB (prewarmed عند 37 درجة مئوية) + المضادات الحيوية المناسبة انتقائية (تحديد المضادات الحيوية الانتقائية على أساس النوع من الاستنساخ ناقلات التجارية المستخدمة). احتضان لوحات عند 37 درجة CO / N.
- اختيار ~ 10 المستعمرات لتنقية مصغرة الإعدادية البلازميد، وذلك باستخدام مجموعة تجارية. يتم تنفيذ مصغرة لتنقية الإعدادية البلازميد بشكل عام على النحو التالي.
ملاحظة: أسماء العازلة هي محددة لعدة التجارية المستخدمة ولكن الوظائف العامة هم مماثلة.- تحصين المستعمرات واحد في 2- 5 مل LB المتوسطة التي تحتوي على المضادات الحيوية المناسبة انتقائية (تحديدها استنادا إلى نوع ناقلات التجارية المستخدمة).
- احتضان لمدة حوالي 8 ساعات في 37 ° C مع قوية تهز (~ 300 دورة في الدقيقة).
- حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي عند 6،000 x ج لمدة 10 دقيقة.
- Resuspend وبيليه في المخزن المؤقت إعادة تعليق 250 ميكرولتر. خلط ودوامة لتفريق تماما بيليه.
- ليز الخلايا البكتيرية عن طريق إضافة 250 ميكرولتر من تحلل العازلة، مزيج دقيق من قبل قلب أنابيب 4-6 مرات.
- تحييد المحللة في المخزن المؤقت تحييد وعكس 4-6 مرات لخلط. أجهزة الطرد المركزي لمدة 10 دقيقة في ~ 17،900 x ج على ميكروسنتريفوج فوق المنضدة.
- نقل supernatants من الخطوة السابقة إلى عمود الدوران. الطرد المركزي مرة أخرى في ~ 17،900 x ج لمدة 30 - 60 ثانية.
- غسل عمود الدوران وذلك بإضافة 0.75 مل غسل العازلة وأجهزة الطرد المركزي ل30 - 60 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
- أجهزة الطرد المركزي لعدد إضافي من 1 دقيقة إلى ريمولقد غسل العازلة المتبقية. ضع عمود الدوران في نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. إلى أزل الحمض النووي، وإضافة الماء 50 ميكرولتر من وسط كل عمود. اسمحوا الوقوف لمدة 1 دقيقة، وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة.
3. تحليل تنقية البلازميدات لوجود إدراج
- تقييد دايجست:
- تشكيل لتقييد هضم لتحديد وجود للإدراج من قبل هضم البلازميد مع إنزيمات تقييد استخدامها لاستنساخ إدراج. وهناك قيود مزدوجة نموذجي هضم رد فعل على النحو التالي: 1 ميكروغرام البلازميد المنقى، 1 ميكرولتر من كل الانزيمات التقييد، 2 ميكرولتر 10X تقييد هضم عازلة + 2 ميكرولتر BSA (إن وجدت)، X ميكرولتر المياه (إلى ما مجموعه 20 ميكرولتر)
- المزيج بلطف واحتضان عند درجة الحرارة الموصى بها (تختلف من إنزيم واحد إلى آخر).
- تحليل تقييد هضم رد فعل على 1٪ TBE هلام الاغاروز، تشغيل في 100 V لمدة 1 ساعة والبحث عن التسرب من الحجم المناسب.
- تحليل PCR:
- انشاء PCR مع البلازميد المنقى، وذلك باستخدام بادئات من منطقة ناقلات تجارية لتضخيم داخل إدراج أو تقاطع بين النواقل وإدراج. الاشعال شيوعا هي إلى الأمام M13 وعكس والاشعال T3 / T7.
- في هذا البروتوكول، واستخدام الدراجات PCR الظروف التالية: عنبر الأولي من 24 ° C، ثم 2 دقيقة في 94 ° C، تليها 18 دورات في 98 درجة مئوية لمدة 5 ثانية و 60 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، و 72 ° C لمدة 2 دقيقة. أداء خطوة التمديد النهائي في 72 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يعقبه عقد إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية.
- المنتجات تحميل PCR على 1٪ TBE هلام الاغاروز والترشح لل100-120 V لمدة 1 ساعة.
- التسلسل:
- إرسال البلازميد المنقى إلى مرفق التسلسل التجاري لتحليل وتأكيد وجود إدراج.
- حالما يتم الحصول على بناء الصحيح، واستخدامها للخطوة الثانية من الاستنساخ (في محطة ناقلات ثنائي).
ملاحظة: خطوات 2،3-3،3يمكن القضاء عليها إذا تم الانتهاء من الاستنساخ في خطوة واحدة.
4. الاستنساخ في ثنائي ناقل النباتات (PRI909) وE. القولونية التحول
- تشكيل لتقييد مزدوج هضم ردود الفعل على خطي متجه ثنائي النباتية وعزل إدراج المستنسخة سابقا باستخدام نفس المواقع انزيم التقييد التي تمت إضافتها إلى الاشعال (الخطوة 2.2).
- تحليل هضم تقييد استخدام هلام الكهربائي، تعمل في 100 V ل1 - 2 ساعة. قطع إدراج والنبات خطي ناقلات ثنائي من هلام.
- استخدام عدة التجارية لتنقية المنتجات هلام. الرجوع إلى دليل الشركة الصانعة.
- إعداد رد فعل ربط لligate إدراج في ناقلات ثنائي النبات. إدراج لنسبة ناقلات يعتمد على حجم إدراج ومتجه ثنائي النبات. في هذا البروتوكول كان إدراج LIS1 6.5 كيلوبايت وكان متجه ثنائي محطة 9 كيلو بايت. وبالتالي، واستخدام 1: إدراج 2 إلى نسبة النواقل.
5. Electroporation للفي الأجرعية المورمة الخلايا المختصة كهربائيا
- ذوبان الجليد قارورة من الأجرعية المورمة الخلايا المختصة كهربائيا على الجليد.
- إضافة 1 نانوغرام من ثنائي DNA ناقلات البلازميد إلى 20 ميكرولتر من الخلايا المختصة، على الجليد، وتخلط بلطف.
- هدئ من كفيت electroporation 0.1 سم على الجليد.
- نقل مزيج خلية / DNA المختصة إلى cuvettes Electroporation لل، والاستفادة لجمع الخليط في الجزء السفلي. وضع كفيت في الجهاز electroporator والنبض (الجهد والوقت الشروط تعتمد على حجم كفيت وelectroporator المستخدمة).
- إضافة 1 مل من وسائل الاعلام SOC والخلايا نقل إلى أنبوب 15 مل.
- احتضان لمدة 1 ساعة على 28-30° C، والهز في 100 دورة في الدقيقة. لوحة 50-100 ميكرولتر من الخلايا على أجار LB + المضادات الحيوية المناسبة انتقائية (تعتمد على البلازميد ثنائي النبات وسلالة من الأجرعية المستخدمة في هذا البروتوكول استخدام 50 ميكروغرام / مل الكاناميسين و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين).
- احتضان لوحات تصل إلى 48 ساعة عند 28-30 درجة مئوية.
- كرر الخطوة 2.5 لاختيار مستعمرة وتنقية البلازميد.
- كرر الخطوة 3 لتحليل البلازميد وللتحقق من سلامة إدراج وT-DNA قبل استخدام التركيبة لالأزهار غمس. كرر الخطوة 3.2، وذلك باستخدام عدة الاشعال PCR في جميع أنحاء المنطقة برمتها إدراج وعبر مناطق T-DNA والتسلسل كما في الخطوة 3.3.
ملاحظة: في هذا البروتوكول تم تصميم 4 الاشعال مختلفة عبر T-DNA و 10 الاشعال عبر إدراج. - بمجرد تأكيد وجود البلازميد ثنائي النباتية في الأجرعية مستعمرة المختارة، مكان الخلايا طن 50٪ الجلسرين وتخزينها في -80 ° C. متجر المستعمرات المتبقية على لوحة في 4 درجات مئوية إذا كانت لاستخدامها خلال أسبوع واحد 7.
6. الأزهار والغمس
ملاحظة: 2 أيام قبل الزهور غمس:
- تنمو الخلايا الأجرعية إلى الطور الثابت (OD 600 بين 0،5-1 هو مقبول) في LB + المضادات الحيوية المناسبة في وسائل الإعلام السائلة.
ملاحظة: هذه هي نفس المضاد الحيوي كما في الخطوة 5.6، استنادا إلى ناقل ثنائي النبات ونوع من سلالة الأجرعية المستخدمة. - بدء الثقافة مع 1: 100 التخفيفات من المشبعة (5 مل) O / N ثقافة وتنمو ل24 - 48 ساعة عند 28-30 درجة مئوية في حين تهتز في 150 دورة في الدقيقة. ثقافة أن تحقق المرحلة midlogarithmic وأكثر من المرجح أن تكون تقترب أو في مرحلة ثابتة 1. OD ما يقرب من 0.8 (مرة أخرى التطوير التنظيمي بين 0،5-1 كلها مقبولة) 8. جمع الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 5،000 Xز في RT.
- resuspend الخلايا في تسلل المتوسطة (5.0٪ سكروز + 0،05-0،003٪ Silwet L-77). للجولة الأولى من غمس، استخدم 0.05٪ Silwet-77. لالجولتين الثانية والثالثة، والحد من تركيز إلى 0.03٪ (المفصل في مناقشة).
- المضي قدما في خطوة الأزهار وتراجع. وضع المصنع على جانبها وتراجع فقط براعم مرئية في المتوسط تسلل لمدة 1-2 دقيقة. ترك المحطة على جانبها وتغطية ذلك مع غلاف بلاستيكي للحفاظ على الرطوبة العالية في القبة (الشكل 3).
- في اليوم التالي، ضع النبات في وضع مستقيم والمحافظة بشكل طبيعي.
- عندما ينمو برعم أكبر (عادة بعد حوالي 10 - 14 يوما)، كرر الخطوات من 6،1-6،4. تقليل الوقت غمس إلى 30 - 60 ثانية وSilwet-77 إلى تركيز 0.003٪.
- الحفاظ على النباتات عادة حتى بذورها ناضجة وجاهزة للجمع (الشكل 4).
7. اختيار إيجابي تراnsformants مع المباشر PCR
- زرع بذور T1 على التربة كما في الخطوة 1.1.
- بدلا من ذلك، جعل وسط موراشج وسكوج الملح القاعدي (MS المتوسطة) وذلك بإضافة 2.2 غرام من MS المتوسطة + 4 غرام من أجار في 500 مل من الماء. الأوتوكلاف وتصب في أوعية النباتات الصغيرة. نضع في 4 ° C حتى استخدامها.
- بذر البذور عن طريق وضعها على MS المتوسطة عزز. تبقي قيد ضوء النهار الطويل (النور 14 ساعة و 10 ساعة من الظلام). سوف تنبت البذور في حوالي 4 - 6 أيام (الشكل 5).
- استخدام بذرة واحدة من كل زهرة كنقطة انطلاق. إذا لم يتم الحصول على المحولة إيجابي، كرر هذه الخطوة عن طريق التقاط البذور آخر من الزهور.
ملاحظة: اختبار البذور مختلفة من نفس الزهور، لأنه في بعض الحالات لا سيتم تحويل جميع البذور من زهرة واحدة. اختيار البذور إضافية من الزهور التجريبية من الضروري في بعض الأحيان.
- اطمئنان على الشتلات بانتظام. في حوالي 10 - 14 يوم بعد الإنبات، عندما صحيحيترك تطوير واختبار النباتات مع PCR المباشر.
- إعداد مستخلص نبات الحمض النووي عن طريق خفض 2 - 3 في الأوراق (من 5 - 10 ملغ في الوزن) من كل الشتلات ووضعها في أنبوب microcentrifuge.
- إضافة 180 ميكرولتر من 50 ملي هيدروكسيد الصوديوم لكل أنبوب، واحتضان لمدة 10 دقيقة في 95 ° C.
- تحييد استخراج بإضافة 20 ميكرولتر من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك (الرقم الهيدروجيني 8.0).
- استخدام 1 ميكرولتر من استخراج في رد فعل PCR المباشر، وذلك باستخدام بادئات مصممة عبر T-DNA أو إدراج (الشكل 7)، لاختيار لtransformants إيجابية.
- في هذا البروتوكول، واستخدام PCR المباشر مع عقد الأولي من 24 ° C، ثم 2 دقيقة في 98 ° C، تليها 40 دورات (98 درجة مئوية لمدة 10 ثانية، وخطوة الصلب لمدة 15 ثانية، وخطوة التمديد في 68 ° C). أداء خطوة التمديد النهائي في 68 درجة مئوية لمدة 5 دقائق يعقبه عقد إلى أجل غير مسمى في 4 درجات مئوية. (راجع الجدول 1 للاطلاع على تفاصيل الاشعال، ودرجات الحرارة الصلب والأوقات التمديد للدورات).
- تحديد transformants إيجابية وتنمو لهم حتى تاريخ الاستحقاق. إذا كانت نبتت البذور في MS المتوسطة، زرع للتربة في وعاء أكبر (الشكل 5).
Representative Results
الشكل 1-4 توضيح بعض الخطوات ضمن البروتوكول. في أرقام 1 و 2، ويترك في جميع أنحاء براعم الإزهار يتم قطع لفضح لهم الخلايا الأجرعية والمراحل برعم المختلفة التي استخدمت لتطوير بروتوكول الشكل يظهر 3 عملية الكتان الأزهار وتراجع الشكل 4، يظهر مثال عن كيفية الفروع الرئيسية والجانبية يمكن أن يكون المسمى وكيف الزهور فرد يمكن تتبع وتحديد الشكل 5 يبين كيف يمكن نبتت على السلالات T1 على وسائل الإعلام مصنع MS ومن ثم زرعها في التربة لنضج الشكل يوضح كيف 6 wild- نوع الكتان يمكن الهروب تركيزات عالية من الكانامايسين، مؤكدا النتائج السابقة في الأدب 6،9،14.
ويبين الشكل 7 مثال PCR التضخيم مباشرة من transformants T1 إيجابية. تم جمع الزهور T1 من م عين والجانب يطلق النار على محطة T0 واحد. كما يمكن أن يرى من PCR المباشر، واختبارها 8/12 النباتات T1 الإيجابية التي PCR ولقد ضخمت في مناطق مختلفة في جميع أنحاء T-DNA. تم تصميم الاشعال لدينا أيضا بين LIS-1 إدراج والمواقع استنساخ متعددة (الشكل 7B وC). كنا الاشعال إضافية من متجه ثنائي مصنع لتضخيم شرائح مختلفة من الحمض النووي T، مثل الحدود الأيسر وفاصل NOS (لا تظهر البيانات) أو الحد الأيمن وموقع استنساخ متعددة (الشكل 7D). واستخدمت بادئات محددة لإدراج LIS-1 أيضا في هذا البروتوكول (لا تظهر البيانات). وهناك قائمة من الاشعال في الجدول 1. ومع ذلك، فإن تسلسل هذه الاشعال تعتمد على سلسلة من متجه ثنائي محطة T-DNA وإدراج المستخدمة لوتراجع الأزهار. لاحظنا أيضا أنه لم يكن هناك اختلاف كبير في معدل التحول بين الزهور التي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية.
ف together.within صفحة = "دائما"> 
الشكل 1. قص الأوراق حول براعم الإزهار الأولية ليعرضهم للخلايا Agrobacterim. (A) وتغطي براعم بواسطة إجازات. وقطعت (B) أوراق حول البراعم لفضح لهم. (C) تضخيم صورة من المصنع في (A) بعد قطع لفضح البراعم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. مراحل برعم المختلفة التي استخدمت في هذا البروتوكول لتحديد أفضل مرحلة لاستخدامه في تراجع الأزهار. (A) المرحلة برعم المبكر هو approxima tely 2 مم. (B) المرحلة برعم المتوسط حوالي 5 ملم. (C) المرحلة برعم المتأخر هو ما يقرب من حوالي 1 سم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. عملية الكتان الأزهار غمس. وانخفض (A) والنورات الأولية في وسائل الإعلام تسلل تحتوي على خلايا الأجرعية. (B) مكبر من (A). (C) وضعت النباتات انخفض شقة حتى اليوم التالي، ويتم تغطية فروع انخفض مع البلاستيك للحفاظ على الرطوبة العالية. اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
. الشكل 4. إن عملية تتبع الزهور والبذور مجموعات من النباتات T0 تعامل (A) مثال على مصنع كامل مع الفرع الرئيسي (أطول فرع في الوسط) والجانب فروع (B - D). إن . مثال الزهور من مختلف فروع (E) مثال من البذور التي تم جمعها من الزهور الفردية (المسمى ل- ك). من الفرع الرئيسي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
تزرع الشتلات الشكل 5. T1 دون اختيار المضادات الحيوية. (A) البذور T1 هينبتت على وسائل الإعلام مصنع MS. (B) transformants إيجابية، على النحو الذي يحدده PCR المباشر، يتم زرعها في التربة ونمت حتى تاريخ الاستحقاق. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
والتغلب على الشكل 6. الهروب المضادات الحيوية، وهي مشكلة لT1 اختيار، من خلال فحص PCR المباشر. (A) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS دون المضادات الحيوية. (B) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على وسائل الإعلام مصنع MS + زيادة تركيزات من الكانامايسين (200 ميكروغرام / مل، 600 ميكروغرام / مل، 1 ملغ / مل). (C) من نوع البرية بذور الكتان نبتت على MS سائل الإعلام المصنع مع 2 ملغ / مل الكانامايسين. (D) PCR من النوع البري الكتان وT1 الشتلات باستخدام بادئات كانامايسين، كل AMPLified والكانامايسين الجين (الأساطير: EZ1: علامة DNA، FlaxS، من النوع البري flaxS، C: السيطرة غير مغموسة فرع، ما: T1 ذرية من زهرة "أ" التي تم جمعها من الفرع الرئيسي، SC، SD، سي، SF: السلالات T1 من الزهور المختلفة "ج، د، ه، و" التي تم جمعها من فرع الجانب، W: لا DNA) الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الرقم 7. مثال على التكبير PCR ناجحة من السلالات T1 باستخدام طريقة PCR المباشر. (A) رسم تخطيطي لناقلات ثنائي مصنع + والمستنسخة LIS-1 إدراج. الأسهم الزرقاء تدل على موقف الاشعال PCR تستخدم في فحص PCR المباشر (معدلة من تاكارا). (ب) PCR مع الاشعال M13F + 3 "(C) PCR مع الاشعال M13R + 18A
| مصدر تسلسل التمهيدي إلى الأمام | تسلسل 5'-3 " | العكسي مصدر تسلسل التمهيدي | تسلسل 5'-3 " | الصلب تيمبراتوري (° C) | الوقت تمديد (ثانية) | حجم المتوقعة (بي بي) |
| M13F (T-DNA) | CTGCAAGGCG ATTAAGTTGG | 3 "(LIS-1 إدراج) | GAGGATGGAA GATGAAGAAGG | 57 | 40 | 450 |
| 18A (LIS-1 إدراج) | TATTTTAACCC | M13R (T-DNA) | ATTAGGCACC | CCAGGCTTTA 57 | 40 | 520 | |
| MCS (T-DNA) | TGGTCATAGC TGTTTCCTGTG | RB (T-DNA) | TTTAAACTGA AGGCGGGAAA | 60 | 20 | 200 |
| LB (T-DNA) | TTTGATGGTG GTTCCGAAAT | NOS (T-DNA) | GAATCCTGTT GCCGGTCTT | 60 | 30 | 380 |
| NPTII (T-DNA) | GCGATACCGT AAAGCACGAG | NTPII (T-DNA) | GCTCGACGTT GTCACTGAAG | 65 | 45 | 502 |
الجدول 1. بعض من الاشعال المستخدمة لاختبار PCR المباشر.
Discussion
في بعض الأنواع النباتية، مثل الكتان (LINUM usitatissimum)، كان ناجحا تحول النبات محدود. سابقا، والتحول في الكتان ويتطلب وجود عدوى الأجرعية التي كتبها جرح وزراعة المشترك، تطبيق الجسيمات biolistic أو باستخدام الموجات فوق الصوتية صوتنة، تليها تجديد. عملية في آن معا منذ فترة طويلة وعرضة للأن يرافقه العديد من الأحداث طفرية. وعلاوة على ذلك، فإن عملية اختيار هذه التقنيات تتطلب استخدام علامات اختيار المضادات الحيوية مثل الكانامايسين. ومع ذلك، فقد لوحظ في الأدب أن هذا الأسلوب في اختيار تنتج العديد من ايجابيات كاذبة، كما يميل الكتان للهروب تركيزات عالية من المضادات الحيوية 6،9،14. وكان ثمة عيب آخر من التقنيات السابقة في التحول الكتان انخفاض معدلات التحول 2،6.
في بروتوكول الموصوفة هنا، وقد تبين الأجرعية تحول النبات بوساطة عبر الأزهار غمسأن يؤدي إلى معدل التحول عالية لالكتان (50 - 60٪). وقد تم الحصول على Transformants من الزهور انخفض والتي تم جمعها من الفروع الرئيسية والجانبية. وقد تم اختيار transformants إيجابية ببساطة عن طريق زراعة النباتات T1 على التربة وفحص أوراقها قريبا بعد أن نبتت، واستخدام المضادات الحيوية-اختيار المارة، وهي خطوة المستخدمة سابقا كقاعدة في الأزهار وتراجع للأنواع النباتية الأخرى. عن طريق إجراء اختبار PCR المباشر من الأوراق، وباستخدام بادئات T-DNA المناسبة، transformants إيجابية يمكن اختيار بسرعة. هذه التقنية بسيطة وغير مكلفة وسهلة لأداء، ولكن النتائج في معدل التحول أعلى بكثير من تلك التي ذكرت سابقا لنبات الأرابيدوبسيس والأنواع النباتية الأخرى باستخدام هذه الطريقة 1،10،12. بل هو أيضا أعلى معدل التحول الإبلاغ عنها من الكتان.
ومع ذلك، هناك خطوات حاسمة في الإجراءات بما في ذلك اختيار أفضل مرحلة زهرة وأفضل تركيز بالسطح، بحيثوالأجرعية يمكن أن تخترق الخلايا النباتية دون قتل أجهزة زهرة. إذا تم استخدام مرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع ارتفاع تركيز Silwet-77 أكثر من 0.05٪، وزهرة لم تتطور ولا تعيين البذور. إذا تم استخدام مرحلة أواخر برعم (الشكل 2C)، على الرغم من أن التحول قد عمل، وسوف تحدث بمعدل أقل من ذلك بكثير. وتم الحصول على نتائج مماثلة مع نبات الأرابيدوبسيس تراجع الأزهار التحول 1،4. لهذا البروتوكول، تم اختبار جميع المراحل الأزهار مع مختلف Silwet-77 تركيزات وتم تحديد أفضل مرحلة لتكون المرحلة برعم المتوسط (الشكل 2C) مع Silwet-77 في 0.05٪ لغمس الأول، تليها غمس الثاني في المرحلة الراحل برعم (الشكل 2C) مع انخفاض طفيف تركيز Silwet-77 من 0.03٪. كما عملت التحول جيدا باستخدام المرحلة برعم في وقت مبكر (الشكل 2A) مع تركيز منخفض silwet-77 من 0.003٪ تلاهغمس الثاني مع مرحلة برعم المتوسط (الشكل 2B) في أعلى Silwet-77 تركيز 0.05٪.
في هذا البروتوكول، وقد حاول بعض المعالم الأخرى لتحسين معدل التحول، ولكن وجد أن له أي آثار على النتيجة النهائية. وتشمل الأمثلة يمتد الوقت بعد غمس أن النباتات تكمن في جانبهم وغطت في البلاستيك من يوم واحد إلى يومين. باستخدام OD أكثر من 1 للثقافة الأجرعية، بدلا من 0،5-1. زيادة الوقت غمس 5 - 15 دقيقة بدلا من 1 - 2 دقيقة. مرة أخرى نحن لم نلحظ أي تأثير على معدل التحول باستخدام هذه الاستراتيجيات. العوامل الأكثر فعالية، ومع ذلك، وجدت أن استخدام النباتات الصحية في المراحل زهرة الصحيحة، واستخدام أفضل تركيز Silwet-77. لاحظنا أن اثنين من فترات غمس، ويعمل بطريقة أو بأخرى الوقت أفضل من واحد، على الرغم من واحد غمس الوقت يعمل أيضا.
لا يمكن أن يتحقق تعديل على هذا البروتوكول من قبل reducin ز تركيز Silwet-77 إلى أقل من 0.003٪ في غمس الثاني أو الثالث. منذ Silwet-77 غير سامة، وارتفاع جدا نتائج تركيز في الزهور النامية على نحو رديء، مما يؤدي إلى أي محصول البذور. يمكن الحد من وتيرة غمس إلى واحد، مع الأحداث الثانية أو الثالثة القضاء إذا النباتات لا يبحثون صحي والبراعم لا تتطور بصورة جيدة.
وهناك أوجه القصور الرئيسية لهذه التقنية هو انخفاض عدد الزهور التي تنتجها الكتان، وعدد محدود من البذور تم الحصول عليها من كل زهرة، ودورة حياة طويلة من الكتان. يستغرق 6-8 أسابيع من بذر البذور لديها براعم الأولية جاهزة لغمس أول وإضافية 8-10 أسابيع بعد غمس-للوصول الى جيل T1. في المجموع، ومجموعة من 5 - هناك حاجة إلى 6 أشهر للحصول على الجيل T1. على عكس الأنواع النباتية الأخرى، والتي زهرة في أي وقت من السنة، وبعض أصناف الكتان زهرة أفضل في أوقات محددة من السنة. تخطيط مدروس جدا لهذا الأسلوب هو المهم.
الحمار = "jove_content"> وباختصار، نتائجنا من تراجع الأزهار مع اثنين من أصناف الكتان مختلفة: الكتان من الألياف، ستورمونت سيروس (البلاستيك استجابة و)، وزيت الكتان، بيتون (مستقر وغير المراعية)، تبين أن الأجرعية - بوساطة تحول النبات عن طريق الأزهار وتراجع هو وسيلة قابلة للتطبيق وفعالة للتحول الكتان، ويمكن استخدامها لتحل محل التقنيات المستخدمة سابقا للتحول الكتان. فإن إدخال تعديلات على طريقة الأزهار وتراجع في هذا البروتوكول تكون قابلة للتطبيق للاستخدام مع أي نوع من الأنواع النباتية الأخرى وليس على سبيل الحصر الكتان.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Flax seeds of the original Stormont Cirrus variety (PL) | |||
| 5" pots | |||
| Potting soil | |||
| Greenhouse with appropriate light setting | |||
| Thermocycler | |||
| Agarose gel electropheresis equipment | |||
| Digital imaging setup | |||
| Silwet-77 | LEHLE SEEDS | VIS-01 | Toxic, wear gloves |
| GoTaq Green Master Mix | Promega | Part# 9PIM712 | |
| Terra PCR Direct Polymerase Mix | Clontech | 639270 | |
| Binary vector PRI 909 | Takara | 3260 | |
| Agrobacterium tumefaciens LBA4404 E | Takara | 9115 | |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4595-01 | |
| Sucrose | Fisher Scientific | ||
| Electroporator and cuvettes | Bio-Rad | 165-2092 | |
| Shaker | |||
| Spinner | |||
| Plastic wrap and aluminum foil wrap | |||
| speedSTAR DNA polymerase | Takara | RR070A/B | |
| QlAquick gel extraction kit | Qiagen | 28704 | |
| QIAGEN plasmid mini kit | Qiagen | 12123 | |
| SalI-HF enzyme | NEB | R3138S | |
| SacI-HF enzyme | NEB | R3156S | |
| T4 DNA ligation kit | NEB | M0202 | |
| Murashige Skoog | Sigma | M5524 | |
| Agar | Fisher Scientific | A360-500 |
References
- Bent, A. Arabidopsis thaliana floral dip transformation method. Methods Mol Biol. 343, 87-103 (2006).
- Beranova, M., Rakousky, S., Vavrova, Z., Skalicky, T. Sonication assisted Agrobacterium-mediated transformation enhances the transformation efficiency in flax (Linum usitatissimum L.). Plant Cell Tiss Organ Cult. 94, 253-259 (2008).
- Chen, Y., Schneeberger, R. G., Cullis, C. A. A site-specific insertion sequence in flax genotrophs induced by environment. New Phytol. 167, 171-180 (2005).
- Clough, S. J., Bent, A. F. Floral dip: a simplified method for Agrobacterium-mediated transformation of Arabidopsis thaliana. Plant J. 16 (6), 735-743 (1998).
- Cullis, C. A. Mechanisms and Control of Rapid Genomic Changes in Flax. Ann Bot. 95, 201-206 (2005).
- Dong, J. Z., McHughen, A. An improved procedure for production of transgenic flax plants using Agrobacterium tumefaciens. Plant Sci. 88, 61-71 (1993).
- Logemann, E., Birkenbihl, R. P., Ulker, B., Somssich, I. S. An improved method for preparing Agrobacterium cells that simplifies the Arabidopsis transformation protocol. Plant Methods. 2 (16), (2006).
- Mara, C., Grigorova, B., Liu, Z. Floral-dip transformation of Arabidopsis thaliana to examine pTSO2::β-glucuronidase reporter gene expression. J Vis Exp. (40), (2010).
- Mlynarova, L., Bauer, M., Nap, J. -P., Pretova, A. High efficiency Agrobacterium-mediated gene transfer to flax. Plant Cell Rep. 13, 282-285 (1994).
- Mu, G., et al. Genetic transformation of maize female inflorescence following floral dip method mediated by agrobacterium. Biotechnology. 11 (3), 178-183 (2012).
- Trieu, A. T., et al. Transformation of Medicago truncatula via infiltration of seedlings or flowering plants with Agrobacterium. Plant J. 22 (6), 531-541 (2000).
- Yasmeen, A., et al.
- Zale, J. M., Agarwal, S., Loar, S., Steber, C. M. Evidence for stable transformation of wheat by floral dip in Agrobacterium tumefaciens. Plant Cell Rep. 28, 903-913 (2009).
- Zhan, X. C., Jones, D. A., Kerr, A. Regeneration of flax plants transformed by Agrobacterium rhizogenes. Plant Mol Biol. 11, 551-559 (1988).
