Abstract
Лизин метилирование новых посттрансляционной модификации и была обнаружена в нескольких гистонов и не белков гистонов, где он играет решающую роль в развитии клеток и многих заболеваний. Примерно 5000 лизина метилирования были определены на различных белков, которые устанавливаются несколько десятков белков лизина метилтрансферазы. Это говорит о том, что каждый PKMT метилирует несколько белков, однако до сих пор только один или два субстраты были определены для нескольких из этих ферментов. Подойти к этой проблеме, мы ввели массив пептид на субстратной специфичности анализа PKMTs. Пептидные массивы являются мощными инструментами для характеристики специфики PKMTs, потому что метилирование некоторых субстратов с различными последовательностями могут быть проверены на одном массиве. Мы синтезировали пептид массивов на целлюлозной мембране с использованием синтезатора Intavis SPOT и проанализировал специфику различных PKMTs. Основываясь на результатах, для некоторых из этих ферментов, роман смогут быть определены ubstrates. Например, для NSD1 с использованием пептидных массивов, мы показали, что метилирует K44 из H4 вместо сообщалось H4K20 и, кроме того H1.5K168 является наиболее предпочтительным субстратом по ранее известной H3K36. Таким образом, пептидные массивы являются мощными инструментами биохимически характеризующие PKMTs.
Introduction
В течение последних двух десятилетий, в нескольких докладах продемонстрировали важность пост-трансляционных модификаций (PTM) в сотовой развития и ряда заболеваний, таких как рак, но в последнее белок лизин метилирование появился как еще один важный ПТМ. В то время как изначально гистона метилирование лизина было установлено, что существенную хроматина знак, а затем работы также показали, лизин метилирование нескольких негистоновых белков 1-4. Последовательное перемещение метильных групп от S-аденозил-L-метионина в ε-аминогруппой остатков лизина катализируется семейством ферментов, называемых белка лизина метилтрансферазы (PKMTs), который содержит более 60 белков в геноме человека. PKMTs были первоначально обнаружен как гистонов модификации ферментов, которые метилировать конкретный остаток лизина, но более поздние сообщения продемонстрировали, что они могут также метилировать негистоновые белки 5. До сих пор, около 5000 лизина метилирования сайты были определены на разных белков 6
Пептидные массивы широко используются средства для биохимического анализа антител, пептидов, модифицирующих ферментов и отображения сайтов белок-белкового взаимодействия (антитело-антиген, рецептор-лиганд) 7-9. Несколько сотен пептидов, необходимых для Sucч приложений. Различные способы доступны для пептидного синтеза, среди которых пептидный синтез на смоле очень широко используется, но имеет ограничения в пропускной способности, и это относительно дорого. Эти вопросы были решены с введением метода синтеза SPOT Франка и его коллеги 10. Способ синтеза точке позволяет синтез нескольких сотен пептидов параллельно и в среднем это недорого по сравнению с синтезом смолы. Пептиды, синтезированные на целлюлозной мембране могут быть использованы либо непосредственно для различных применений или пептидов могут быть расщеплены из мембраны и используют в качестве свободных пептидов в растворе для анализов или приготовить пептид микрочипов 10-13.
Синтез пятно вариант твердофазного пептидного синтеза, который использует в качестве целлюлозы мембраны с твердым носителем, и использует стандартный Fmoc-химии 10-13. Следовательно, синтез пептидных цепей начинается в конце C-концевой и переходит кконец N-терминал в отличие от биологического синтеза в рибосомах. Целлюлозные мембраны функционализированные для крепления первого активированного аминокислот (рис. 1). Способ пятно на основе последовательного доставки активированных аминокислот в капле растворителя для определенных точек на мембране с использованием автоматизированной системы пипетирования. Капелек жидкости распределяется на пористой мембране, где он образует круглое мокрое пятно, которое затем действует в качестве открытого реактора для химических реакций в синтезе пептидов. Размер пятна определяется объем разливаемого и поглотительной способности мембраны, кратные таких местах расположены как массивы. Шкала синтеза коррелирует с размером пятна и грузоподъемностью мембраны. Расстояние между пятнами и плотности массивов управляются путем изменения размеров пятна. Целлюлоза мембрана имеет несколько преимуществ, как твердой фазы в синтезе пептидов, недорого, толерантных к химикоALS, используемые в синтезе пептидов, стабильные в водных растворах и прост в обращении. Кроме того, его гидрофильность делает его пригодным для нескольких биологических тест-системах. Синтез пятно может осуществляться вручную или автоматически (по 1000s пептидов) в зависимости от требуемого количества пептидов. Полностью автоматизированный синтезатор SPOT из Intavis (Köln, Германия) используется для наших приложений. Это позволяет синтезировать пептиды в различных количествах и разной длины. Линейные пептиды регулярно синтезировали с длиной от 15 до 20 аминокислот, в дополнение пептидов до 42 аминокислот могут быть также получены путем ступенчатого синтеза 14,15. Тем не менее, увеличение числа аминокислот приводит к снижению общих выходов связи, что влияет на качество пептидов. Из-за малого количества пептидов в месте, продукты зачастую трудно очистить и качество индивидуальных пептидов не может быть легко оценена. Таким образом, результаты, полученные с места PeptIDE массивы должны быть подтверждены либо пептидов, синтезированных с помощью стандартных методов в более широком масштабе, которые могут быть очищены и проанализированы в соответствии со стандартами в пептидного синтеза или путем синтеза белков, содержащих желаемые последовательности пептида. Тем не менее, мы обнаружили, что синтез место, чтобы быть очень надежным и результаты, как правило, чтобы быть воспроизводимым. Синтез пятно не ограничивается протеиногенных аминокислоты, несколько коммерчески доступных модифицированные аминокислоты также могут быть использованы для синтеза, что позволяет пептиды, которые будут изменены до и после окончательного расщепления защитной группы боковой цепи и, кроме того, она также позволяет включение Фосфорилированные, метилированных или ацетилированного аминокислоты 11.
Иммобилизованные пептидных библиотек, синтезированные по методу SPOT могут быть непосредственно использованы для многих биологических и биохимических анализов. Мы использовали пептидные массивы, содержащие 300-400 пептиды исследовать субстратной специфичности PKMTs. Для ферментативного modifiКатион, массивы пептидные инкубируют с соответствующим PKMT и помечены [метил- 3 H] -AdoMet в соответствующем буфере. Метилирование соответствующего субстрата анализировали с помощью следующих ферментативной передачу радиоактивно меченных метильных групп от AdoMet к пептидного субстрата с помощью авторадиографии (рис. 3). В результате этой процедуры, массивы пептидные позволить изучение метилирования различных пептидных субстратов, в то же время. Одним из важных преимуществ этого метода является то, что все пептиды метилированный в конкуренции, таким образом, что при линейной фазы метилирования кинетики, относительная метилирование каждого пептида пропорциональна каталитической константы скорости, деленное на константу диссоциации (K / K кошки D) фермента для соответствующего пептидного субстрата. Таким образом, количество радиоактивности включены в каждом месте непосредственно коррелирует с ферментативной активностью по отношению к конкретной пептида. ИспользованиеРезультаты метилирования эксперимента пептид массива, специфика профиль PKMT могут быть определены и на основе этого новых подложек могут основываться. Пептидные массивы позволить быстрое и экономически эффективное проверку метилирования новых субстратов на уровне пептидной. Для этого, массивы, которые содержат получают прогнозируемые новые субстраты с модифицированными пептидами, содержащими Ala вместо Lys в целевых объектов, а также положительных и отрицательных контрольных пептидов. Наконец, новые субстраты могут быть получены, как белки совместно с мутантами, в котором целевая Lys изменяется в Ala и метилирование может быть подтверждено на уровне белка. В зависимости от результатов, это затем следуют биологических исследований, касающихся потенциальной роли метилирования вновь описанных белковых субстратов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Подготовка пептида массивов
- Программирование пептидных последовательностей
- Дизайн пептидных последовательностей для синтеза с помощью программного обеспечения MultiPep Spotter. Введите пептидных последовательностей в отдельных буквенные коды.
Пептид 1: TARKSTGGKA - Создание на экран важные аминокислоты, необходимые для признания определенного субстрата, аланин или аргинин ходьбы библиотеки с определенной командой (.Привернуть, а). Например, в следующем примере первая строка последовательности дикого типа и со второй линии каждая аминокислота в пептиде изменяется на аланин последовательно.
заменить, А
TARKSTG
-ARKSTG
Т -RKSTG
ТА- -KSTG
Мишени -STG
TARK- -TG
TARKS- -G
TARKST- - Используйте подобные команды (.Привернуть R,.заменить N и т.д.), как описано в 1.1.2 со всеми, естественно, доступных аминокислотных остатков (в конечном счете, минуя цистеин, метионин и триптофан, потому что эти остатки склонны к окислению, а иногда и более низкий выход синтеза), чтобы синтезировать пептид массив для определения консенсуса мотив последовательности субстрат для фермента.
Примечание: Как показано на фиг.4А, горизонтальная ось представляет данный пептид последовательность, а вертикальная ось представляет аминокислот, выбранных для команды. Как и в последовательности, показанной на 1.1.2, на вертикальной оси означает, что последовательно Ала заменяет каждый положение в данной последовательности в первом ряду на фиг. 4А. Аналогично аргинин последовательно заменяет каждый аминокислоту во втором ряду, и так далее с другими аминокислотами. Полные библиотеки пептидной массива синтезированы путем систематического замены каждого остатка в пептидной последовательности, представленной подложки с каждой из гое другие, естественно, доступные аминокислотные остатки, это помогает понять влияние каждого остатка в каждой позиции заданной последовательности. - Кроме того, метилирование известных или прогнозируемых пептидных субстратов могут быть легко проверены синтеза пептидных библиотек с целевыми пептидов PKMT вместе с элементами управления положительным и отрицательным метилирования (т.е. пептиды, известные метилированы или заведомо не метилировать). Синтезируют пептиды путем обмена предполагаемый целевой лизина на аланин, чтобы подтвердить метилирование мишени лизином, как показано ниже с помощью ручного программирования.
Дикого типа пептид: STGG K PRQFL
Mutant пептид: STGG PRQFL
ПРИМЕЧАНИЕ: программное обеспечение также имеет присущие сценарии для создания различных библиотек, как картирования эпитопов с желаемой сдвига рамки последовательности к карте важные аминокислоты, необходимые для взаимодействия.
- Дизайн пептидных последовательностей для синтеза с помощью программного обеспечения MultiPep Spotter. Введите пептидных последовательностей в отдельных буквенные коды.
- Подготовка мембраны, АминокислотыD Реагенты
- Pre-набухание SPOT мембраны в DMF (N, N-диметилформамиде) в течение 10 мин, а затем поместить влажную мембрану на синтезаторе рамка точечного без воздушных пузырьков или морщин.
- Промыть мембраны три раза 100% -ным этанолом. Сушат мембраны полностью в течение по меньшей мере 10 мин до начала программы синтеза.
- Параллельно, недавно подготовки 0,5 м Рабочая концентрации коммерчески доступных Fmoc-защищенных аминокислот путем растворения их в NMP, а также подготовить активатор и базу, как описано в таблице 1.
- Убедитесь, что все решения Контейнеры синтезатора SPOT были освобождены и пополнить растворителя резервуары с DMF, этанол и пиперидина.
ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь машина готова для синтеза.
- Зрительные из первой аминокислоты
- Для создания амидной связи с свободной аминогруппой на мембране, активировать карбоксильную группу входящего аминокислоты с объявлениемДин активатор (N, N 'диизопропилкарбодиимид) и щелочной раствор (этил цианоацетата гидроксиимино) к производным аминокислоты.
- Пятно желаемых объемов активированных аминокислот на амино-ПЭГ функционализированного мембраны с использованием программируемого робота.
Примечание: Таким образом, С-концевой аминокислоты соединен с аминогруппой мембраны. - Повторите этот шаг три раза, чтобы обеспечить лучшее сцепление первого активированной аминокислоты. Инкубируйте мембрану в течение 20 мин, а затем промыть ДМФ, чтобы удалить несвязанные аминокислоты.
- Блокирование свободных пространств на Non-площадей пятен
Примечание: После связывания первого С-концевой аминокислотой всех пептидов к аминогруппе мембраны, аминогруппы между пятнами, а также некоторые из аминогрупп в пределах местная областей не образовывать связи с аминокислотами.- Блокировать эти свободные аминогруппы путем инкубации с раствором покрывая (уксусный ангидрид в ДМФ 20%)в течение 5 мин.
Примечание: Это позволяет избежать соединение аминокислот в последующих циклах с мембраной вместо растущей пептидной цепи.
- Блокировать эти свободные аминогруппы путем инкубации с раствором покрывая (уксусный ангидрид в ДМФ 20%)в течение 5 мин.
- Удаление Fmoc группы
- После блокировки, мыть мембрану с ДМФ в 4 раза, а затем инкубируют с 20% пиперидином в ДМФ в течение 20 мин, чтобы удалить группу Fmoc защиты.
Примечание: Этот шаг приводит к удалению из аминозащитных Fmoc групп, и это называется снятие защиты. - После этого вымойте мембрану дважды ДМФА и дважды с этанолом и дайте ему высохнуть.
Примечание: В настоящее время мембраны готов к муфте из следующих аминокислот.
- После блокировки, мыть мембрану с ДМФ в 4 раза, а затем инкубируют с 20% пиперидином в ДМФ в течение 20 мин, чтобы удалить группу Fmoc защиты.
- Удлинение цепи
Примечание: Добавление каждой аминокислоты называется циклом. Кроме сцепления первой аминокислоты, цикл начинается с удалением защитной группы Fmoc группы в сочетании аминокислоты и за ним следует муфты активированного карбоксильной группой входящего аминокислоты к аминогруппе растущей PEPприлив цепи.- Повторите этапы 1,3 и 1,5 до желаемой длины пептида не будет достигнута.
- Окрашивание
Примечание: После последнего цикла, массивы пептидные окрашивали бромфенола синего для подтверждения успешного синтеза пептидов. Бромфенолового синего связывается со свободными аминогруппами пептидов. Пептидные пятна показывают светло-голубой цвет после окрашивания, но интенсивность пятен изменяется в зависимости от пептидной последовательности. Это окрашивание дает подтверждение полного удаления пиперидина, потому что в присутствии пиперидина бромфенола синего не окрашивает пептидов. Кроме того, это также помогает в честь пептидные массивы для дальнейшего использования.- После удаления защитной группы Fmoc группы в последнем цикле синтеза, мыть мембрану ДМФ и 100% -ным этанолом. Затем обработать мембрану с бромфеноловым синим (0,02% бромфенола синего) в ДМФ в течение как минимум 5 мин до тех пор, пока полностью становится синим.
- После этого вымойте мембраны ДМФ и ETHAnol с последующей сушкой в течение 10 мин. Теперь возьмите мембрану от синтезатора и выполнять боковой цепи снятие защиты (раздел 1.8) вручную. При необходимости сфотографировать мембраны к документу результаты синтеза пептидов (фиг. 2).
- Боковой цепи Снятие защиты
- Лечить мембран с 20 до 25 мл боковой цепи снятия защиты смеси, состоящей из 95% -ной трифторуксусной кислоты (ТФК), чтобы расщепить защитных групп боковой цепи и мусорщик реагенты (2,5% воды и 2,5% триизопропилсилана), чтобы защитить боковые цепи аминокислот с Изменение на этом этапе. Возьмите достаточный объем снятия защиты смесь, чтобы она охватывает мембраны полностью в плотно закрытой химически стойкого поле и инкубировать ее в течение 1 2 ч при встряхивании осторожно.
- Промыть мембраны шесть раз с 20-25 мл DCM (дихлорметан) в течение 2 мин каждого, и, наконец, дважды 100% этанолом и высушить в эксикаторе в течение ночи.
ПРИМЕЧАНИЕ: ТеперьМембрана может быть использован для проведения экспериментов. Схема синтеза пептида массива обеспечивается на фиг.1.
2. Экспрессия белка и очистка
- Экспрессия белка из PKMTs как GST Fusions
- С использованием стандартных методик, клонировать ген, кодирующий полную длину PKMT или его каталитический домен в бактериальный экспрессирующий вектор pGEX (как-6p2), чтобы выразить как GST-гибридного белка.
- Перевести вектор с требуемой PKMT вставить в BL21 или BL21 кодона плюс Е. палочки клетки методом теплового шока или любым другим способом.
- Подготовка предварительной культуры с 30 мл Лурии-Бертани (LB) сред в день экспрессии и инкубировать при 37 ° С в течение от 7 до 8 ч при непрерывном встряхивании.
- Далее, передача 10 мл предварительной культуры в 2-литровую больших перегороженных колбах, содержащих 1 л LB СМИ и инкубировать при 37 ° С в инкубаторе с продолжительным встряхиванием до недоступном культурыES определяется оптическая плотность при 600 нм.
Примечание: В то время как это может быть оптимизирована для каждого белка, мы обычно вызывают на OD 600 нм приблизительно 0,8. Температура индукции должен быть оптимизирован для каждого белка в отдельности, некоторые белки показывают хорошую экспрессию в 22 ° С, а некоторые при более высоких температурах. - Сдвиг клеток до температуры индукции в течение 15 мин, затем индуцируют 1 мМ изопропил-бета-D-тиогалактопиранозида и позволить культуры расти в течение 10-12 ч при температуре индукции.
- После сбора клеток путем центрифугирования при 5000 х г в течение 15 мин и, наконец, мыть гранул с 30 мл STE буфера (10 мМ Трис, рН 8,0, 100 мМ NaCl и 0,1 мМ ЭДТА) и хранить при -20 ° C для дальнейшего использования.
- Protein Purification
- Оттепель осадок клеток и повторно приостанавливать в 30 мл буфера для обработки ультразвуком (50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 5% глицерина) и разрушают обработкой ультразвуком.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот буфер нeeds быть оптимизированы для каждого белка в конечном счете. - Центрифуга клеточного лизата на 22000 х г в течение 1 ч, а затем собирают супернатант и пройти через колонку, содержащую 600 мкл глутатион-сефароза 4В смолы.
- Промыть колонку с 50 мл буфера для обработки ультразвуком и затем с 100 мл буферного раствора с высоким (50 мМ Трис, рН 7,5, 500 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 5% глицерина), чтобы удалить неспецифически связанных белков. Элюции связанный белок с 5 мл буфера высокой соли, содержащей 40 мМ глутатиона.
- Диализировать элюированного белка в 2 л буфера для диализа с низким глицерина (20 мМ Трис, рН 7,4, 100 мМ KCl, 0,5 мМ ДТТ и 10% глицерина) в течение 2 ч, а затем в 20 мМ Трис, рН 7,4, 100 мМ КСl, 0,5 мМ ДТТ и 70% глицерина в течение 8 ч или в течение ночи. Убедитесь, что все буферы очистку при 4 ° С и проводили очистку белка в холодной комнате, чтобы избежать денатурации белка.
- Оттепель осадок клеток и повторно приостанавливать в 30 мл буфера для обработки ультразвуком (50 мМ Трис, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 1 мМ DTT и 5% глицерина) и разрушают обработкой ультразвуком.
3. Пептид Массив Метилирование
- Pre-INCUщение пептидных массивов
- Выполните пептид массива метилирование или в коробке подходящего размера или в полиэтиленовый пакет, чтобы избежать потерь фермента и дорогой радиоактивно меченого AdoMet. Предварительно инкубируют пептидной массива мембрану в герметичный пластиковый пакет, содержащий соответствующий буфер метилирования без фермента и меченого [метил-3Н] -AdoMet в течение 10 мин. Объем буфера зависит от размера массива, например, использовать 8 мл буфера метилирования на полный профиль специфичности пептидов массива. Оптимизация количества и концентрации AdoMet для каждого фермента.
- Метилирование пептидов массивов
- Отменить буфер предварительной инкубации и инкубировать мембрану в 8 мл метилирования буфере, содержащем соответствующую PKMT и помечены [метил-3H] -AdoMet течение от 1 до 2 ч.
ПРИМЕЧАНИЕ: Количество фермента, необходимого для реакции метилирования зависит от активности конкретного PKMT, мы начинаем наши скрининга эксперименты, как правило, с 50 нм фермента плавникааль концентрация.
- Отменить буфер предварительной инкубации и инкубировать мембрану в 8 мл метилирования буфере, содержащем соответствующую PKMT и помечены [метил-3H] -AdoMet течение от 1 до 2 ч.
- Стиральная пептидных массивов
- После этого буфер метилирования в радиоактивных отходов контейнер и промыть массивы пептидные в течение 5 раз с 20 мл буфера, содержащего 100 мМ бикарбоната аммони и 1% SDS в течение 5 мин, чтобы удалить связанный белок. Откажитесь от моющего буфера в радиоактивном контейнер для отходов.
- Обнаружение радиоактивных сигнала
- После промывок мембрану инкубируют в течение 5 мин в 10 мл раствора амплификации (NAMP100V).
- Тогда, удалите усилить решение в радиоактивных контейнер для отходов органических растворителях, печать массив пептида в полиэтиленовый пакет и положите его в ауторадиографии кассеты.
- Поместите Авторадиография фильм на массиве пептида в темной комнате. Тщательно закройте кассету и выставить его на -80 ° C в течение необходимого времени. Тогда, развивать фильм для анализа результатов. Захват изображения несколько раз с разными Expositioп раз, чтобы избежать насыщения сильно метилированных пептидных субстратов.
4. Обработка и анализ данных
- Денситометрический Анализ Местная интенсивностей
- Сканирование пленки в обычной сканера и анализировать интенсивность пятна с помощью денситометрии. Сделайте это с помощью ImageJ (который является бесплатным) или коммерческие программы.
ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем программное обеспечение Phoretix для этой задачи.
- Сканирование пленки в обычной сканера и анализировать интенсивность пятна с помощью денситометрии. Сделайте это с помощью ImageJ (который является бесплатным) или коммерческие программы.
- Нормализация и усреднение результатов различных мембран
- Проведите пептид массива метилирования эксперименты по крайней мере, в трех экземплярах. Нормализация отсканированные интенсивности для каждого эксперимента вычитание фона и настройка деятельность при нормальной субстрата, как 1,0. Усреднять данные для отдельных пятен и сообщить им, как средние значения и стандартные отклонения.
- Анализ и отображение данных
- Участок данных в 2D, используя в оттенках серого или цветной схемы для указания относительной активности. Делайте это Wiго Excel или Sigmaplot, как показано здесь. Кроме того, подготовить график распределения стандартного отклонения повторных экспериментов для анализа качества данных.
- Для сравнения и отображения точность распознавания каждого остатка в субстрате пептида количественно, вычислить относительную предпочтительность в PKMT для каждой аминокислоты в положении I, х на фактор дискриминации D 16,17:
D X; я = <V J ≠ I> / V я - 1
Где v я это скорость метилирования пептида варианта проведения аминокислоту я в положении х и <V J ≠ I> Is средняя скорость метилирования всех 19 пептидов, несущих различную J аминокислот ≠ I в положении х (в том числе последовательность дикого типа).
ПРИМЕЧАНИЕ: коэффициент дискриминации определяется это зависит от фонового уровня. Если только один остаток принимается в определенном положении с фоном 3%, дискриминациифактор 32,3 получается. В положении предпочтение не приводит к коэффициента дискриминации 0.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Пептидные массивы были успешно использованы биохимически охарактеризовать специфику PKMTs, и были определены несколько новых гистонов и негистоновые субстраты PKMT при таком подходе 5,16-19. Определение правильного субстрата спектр PKMT (или любой фермент) является важным шагом на пути к пониманию ее молекулярного механизма и клеточных функций.
В качестве примера применения пептидных SPOT метод массива метилирования, мы описываем результаты специфичность анализа NSD1 PKMT 19. До нашей работы, этот фермент был описан метилировать нескольких поверхностей, включая гистона H3 на K36 и гистона Н4 в K20, но и семейной фактора транскрипции р65 NF-KB в K218 и K221. Рис. 4A показан пример реакции метилирования массива пептида с NSD1. Для этого эксперимента, большой массив пептиду, основанному на H3 (31-49) последовательность синтезируют, который содержит все возможныеодиночные аминокислотные изменения исходной последовательности, чтобы проверить значение каждой аминокислоты в NSD1 взаимодействия и метилирование. В общей сложности 380 были синтезированы пептиды (20 возможных аминокислот X 18 остатков плюс один исходную последовательность H3 в каждой строке). Горизонтальная ось представляет последовательность пептида и в вертикальном направлении аминокислота, которая изменяется в соответствующем пептида указывается. Например, участок, на линии 17 колонки 4 содержит треонин в третьем положении вместо глицина, который присутствует в последовательности дикого типа (фиг. 4A). Таким образом, точечные мутации генерируются для проверки предпочтение NSD1 для каждого нативной аминокислотной на каждой позиции в пептидного субстрата. Метилирование с NSD1 показал, что специфически воздействует на H3K36 и имеет предпочтения по обе стороны от целевой лизина от 34 до 38.
4В представляет собой объединение трех пептидов массива метилированияЭксперименты с NSD1. Количественная информация была приобретена у отдельных массивов пептидных и результаты были нормализованы, и в среднем, как описано выше. Стандартные отклонения отдельных средних показывают, что данные легко воспроизводимым. В целом около 85% пептидов показывает СД меньше, чем 20% и более 97% из пептидных субстратов показали, SDS меньше, чем на 30% (фиг. 4C). Кроме того, мы также рассчитывается коэффициент дискриминации точно определить вклад каждой аминокислоты в испытуемых позиций. Как описано обеспечивает количественное описание пептида считывать и предпочтение аминокислот в определенном положении (фиг. 5А). Наши данные показывают, что NSD1 предпочитает ароматические остатки в положении -2 (с учетом K36 как положение 0) (F> Y> G); гидрофобные остатки на -1 (I> L> V); Основные остатки на 1 (R> QKNM), где она не может терпеть гидрофобные или ароматические остатки; и гидроксиrophobic остатки в 2 (V> IA> Р). В других местах (например, -3, +3 или +6), NSD1 предпочитает некоторые аминокислоты, но не сильной Остаток конкретных считывания не было обнаружено.
На основании этого профиля, потенциальные новые пептидные субстраты могут быть найдены с помощью поиска в базе данных, как с помощью Scansite 20 (фиг. 5B). Эти пептиды были получены в массиве SPOT в том числе положительных и отрицательных контролей и инкубировали с NSD1 и радиоактивно меченый AdoMet идентифицировать подмножество из них, которые метилированный на уровне пептида (фиг. 5C). Как следует окна, пептидные массивы, могут быть получены, которые включают пептидные варианты, в которых мишенью лизина замещен аланином, чтобы подтвердить, что метилирование происходит в предсказанного сайта. Затем целевые белки или субдомены из них, содержащие целевое лизина могут быть получены рекомбинантно и метилирование также тестировали на уровне белка. Наконец, в зависимости от результатов, следить за эксперименты я могу nvestigate если метилирование также происходит в клетках и которые биологическая роль до сих пор.
Рисунок 1:. Схема синтеза пептидов методом пятно на целлюлозной мембране Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2:. Пример массива пептида, окрашенных бромфенолового синим, подтверждая синтез пептидов Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
p_upload / 52203 / 52203fig3highres.jpg "/>
Рисунок 3: Схема эксперимента пептид массив метилирования; Пептидные массивы метилированный путем инкубации с PKMT и помечены [метил- 3 H] -AdoMet в соответствующем буфере. После радиоактивность передается каждой точке определяется авторадиографией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Пример результатов, полученных с NSD1 PKMT A) Пример пептидной массива субстратной специфичности для NSD1, используя H3 (31-49) последовательность в качестве шаблона.. Горизонтальная ось представляет собой последовательность H3, а вертикальная ось представляет аминокислоты, с помощью которого соответствующий строка мутированные. Первая строка содержит пептиды сисходная последовательность. B) Консолидация результатов 3 независимых пептид массив метилирования экспериментов с NSD1, данные были усреднены результаты всех трех экспериментов, после нормализации.) Распределение стандартной ошибки для средних данных метилирования показано на панели В. Воспроизводится по Kudithipudi и др и др. (2014) с некоторыми изменениями 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5:. Открытие новых PKMT субстратов) Дискриминация факторы NSD1 для признания аминокислотных остатков в позициях рядом с целью лизина (K36 в эксперименте показано здесь). Данные показывают, что NSD1 предпочитает ароматические остатки в р -2osition (с учетом K36 как положение 0). Гидрофобные остатки отражаются по 1 и 2 позиции, хотя и с отличительными различиями в деталях. На месте один предпочтительны основные остатки и амиды. В других сайтов некоторые слабые предпочтения, но не сильный остаток конкретных считывания обнаружено не было. В) Скриншот примерной обыска в Scansite, используя профиль специфичность определяется для NSD1. С) пептида SPOT массив, содержащий несколько предсказал роман NSD1 субстратов вместе с положительным (H3K36 ) и отрицательный контроль (H3K36A). Некоторые из основывается новых объектов были сильно метилированы (некоторые из них аннотированный), в других случаях не могут быть проверены предсказания. Панель и C воспроизводится из Kudithipudi и др. (2014) с некоторыми изменениями 19. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этой цифры.
| База | 1 M Oxyma чистые NMP -> 2,13 г Oxyma Pure в 15 мл NMP |
| Активатор | 2,4 мл N, N 'диизопропилкарбодиимид в 15 мл N-МП |
| Покрывая Смесь | Уксусного ангидрида в ДМФ 20% -> 6 мл уксусного ангидрида в 30 мл ДМФА |
| Fmoc Снятие защиты | 20% пиперидина в DMF -> 200 мл в 1000 мл DMF |
| Sidechain Снятие защиты | 900 мкл триизопропилсилана + 600 мкл DDH 2 O в 30 мл TFA |
| Окрашивание | 0,02% бромфенол синий в ДМФА |
Таблица 1: Химические смеси и их состав, используемый в протоколе.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Синтез SPOT, как описано здесь мощный метод для отображения сайтов белок-белковые взаимодействия и исследовать признание подложки пептидных изменения ферментов. Тем не менее, синтез SPOT-прежнему имеет определенные недостатки, потому что, хотя пептиды, синтезированные по методу SPOT, как сообщается, больше чем 90% чистоты 21, это трудно подтвердить в каждом случае. Таким образом, результаты должны быть воспроизведены другими методами, например, с использованием белковых доменов или с очищенных пептидов, синтезированных с помощью стандартных методов. Кроме того, другой главный недостаток массивов пятно, что большую часть времени они не могут быть повторно использованы, чтобы провести несколько анализов с одного массива.
Для повышения эффективности синтеза аминокислот с низкой стабильности, как и защищенного аргинина, важно, чтобы сделать их свежими в течение каждых 5 циклов. В ферментативных реакций или связывания белка исследованиях часто наблюдается, что периферия пептидной месте имеет месRe интенсивности сигнала, чем в центре ("кольцевой эффект" пятна). Этот эффект может быть из-за высокой плотности пептидов в центральной части в месте, а затем он может быть решена путем уменьшения масштаба пептидный синтез 22. Для получения дополнительной диагностике неисправностей синтеза пептидов машины справочник-сервисная компания следует консультироваться. Если метилирование не наблюдается, положительный контроль пептиды (например, пептиды, как известно, метилированный ферментом исследуемого) следует добавить к мембране.
Альтернативные Точечный массивов, высокая плотность пептидные микро массивы 23 доступны, но они более дорогие и требуют специального оборудования для использования. Кроме того, количество пептида в месте меньше, что требует более чувствительных процедур считывания. Белковые массивы также изучать эти функции 24,25, но они более сложны в приготовлении, так как каждый отдельный белок должен быть экспрессирован и очищен, исворачивания белка в массиве должен быть сохранен. Дополнительным преимуществом пептидных массивов возможное введение пост-модификаций поступательных в процессе синтеза и легкость мутационного тестирования роли отдельных аминокислотных остатков.
Это является важным отправной точкой для этого протокола, чтобы иметь по крайней мере один пептид, идентифицированный, который метилированный ферментом при исследовании. Условия метилирования и буферы должны быть оптимизированы, а также концентрация метилтрансферазы. Примеры программы обучения метилирования должны быть определены, чтобы избежать полного метилирование лучшей подложки, что приведет к потере динамического диапазона.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ethanol abs Gradient Grade HPLC | Honeywell | 10299901 | Flammable |
| N,N-Dimethylformamide Peptide Synthesis | Biosolve | 4193302 | Flammable, Toxic |
| Piperidine ≥99% for Peptide Synthesis | Roth | A122.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Oxyma Pure (Ethyl (hydroxyimino)cyanoacetate ) | Novabiochem | 8510860100 | |
| N,N’-Diisopropylcarbodiimide purum ≥98% GC | Fluka | 38370 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Acetic anhydride | Roth | CP28.1 | Flammable, Toxic, corrosive |
| Triisopropylsilane 99% | Aldrich | 233781 | Flammable, Toxic |
| Dichlormethane ≥99.9% | Roth | P089.1 | Carcinogenic |
| N-Methyl-2-Pyrrolidone | Roth | 4306.2 | Toxic |
| Derivatized cellulose Membrane | Intavis AG Köln | 32.1 | |
| Trifluoroacetic acid | Roth | P088.2 | Toxic, corrosive |
| Bromphenolblue | AppliChem | A3640.0010 | |
| Ammonium Hydrogen Carbonate | Roth | T871.2 | Toxic |
| Sodium Dodecyl Sulfate Pellets | Roth | CN30.3 | Toxic, Flammable |
| MultiPep Synthesizer | Intavis AG Köln | n.a. | |
| HyperfilmTM high performance film | GE Healthcare | 28906837 | |
| Phoretix software | TotalLab | n.a. |
References
- Margueron, R., Reinberg, D. Chromatin structure and the inheritance of epigenetic information. Nat. Rev. Genet. 11, 285-296 (2010).
- Dawson, M. A., Kouzarides, T. Cancer epigenetics: from mechanism to therapy. Cell. 150, 12-27 (2012).
- Helin, K., Dhanak, D. Chromatin proteins and modifications as drug targets. Nature. 502, 480-488 (2013).
- Clarke, S. G. Protein methylation at the surface and buried deep: thinking outside the histone box. Trends in Biochemical Sciences. 38, 243-252 (2013).
- Rathert, P., et al. Protein lysine methyltransferase G9a acts on non-histone targets. Nature Chemical Biology. 4, 344-346 (2008).
- Hornbeck, P. V., Chabra, I., Kornhauser, J. M., Skrzypek, E., Zhang, B. PhosphoSite: A bioinformatics resource dedicated to physiological protein phosphorylation. Proteomics. 4, 1551-1561 (2004).
- Reineke, U., Volkmer-Engert, R., Schneider-Mergener, J. Applications of peptide arrays prepared by the SPOT-technology. Current Opinion in Biotechnology. 12, 59-64 (2001).
- Winkler, D. F., Andresen, H., Hilpert, K. SPOT synthesis as a tool to study protein-protein interactions. Methods Mol. Biol. 723, 105-127 (2011).
- Leung, G. C., Murphy, J. M., Briant, D., Sicheri, F. Characterization of kinase target phosphorylation consensus motifs using peptide SPOT arrays. Methods Mol. Biol. 570, 187-195 (2009).
- Frank, R. The SPOT-synthesis technique. Synthetic peptide arrays on membrane supports--principles and applications. Journal of immunological methods. 267, 13-26 (2002).
- Hilpert, K., Winkler, D. F., Hancock, R. E. Peptide arrays on cellulose support: SPOT synthesis, a time and cost efficient method for synthesis of large numbers of peptides in a parallel and addressable fashion. Nature protocols. 2, 1333-1349 (2007).
- Li, S. S., Wu, C. Using peptide array to identify binding motifs and interaction networks for modular domains. Methods Mol. Biol. 570, 67-76 (2009).
- Winkler, D. F., Hilpert, K., Brandt, O., Hancock, R. E. Synthesis of peptide arrays using SPOT-technology and the CelluSpots-method. Methods Mol. Biol. 570, 157-174 (2009).
- Toepert, F., et al. Combining SPOT synthesis and native peptide ligation to create large arrays of WW protein domains. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 42, 1136-1140 (2003).
- Volkmer, R. Synthesis and application of peptide arrays: quo vadis SPOT technology. Chembiochem : a EuropeanJournal of Chemical Biology. 10, 1431-1442 (2009).
- Rathert, P., Zhang, X., Freund, C., Cheng, X., Jeltsch, A. Analysis of the substrate specificity of the Dim-5 histone lysine methyltransferase using peptide arrays. Chemistr., & biology. 15, 5-11 (2008).
- Kudithipudi, S., Dhayalan, A., Kebede, A. F., Jeltsch, A. The SET8 H4K20 protein lysine methyltransferase has a long recognition sequence covering seven amino acid residues. Biochimie. 94, 2212-2218 (2012).
- Dhayalan, A., Kudithipudi, S., Rathert, P., Jeltsch, A. Specificity analysis-based identification of new methylation targets of the SET7/9 protein lysine methyltransferase. Chemistr., & Biology. 18, 111-120 (2011).
- Kudithipudi, S., Lungu, C., Rathert, P., Happel, N., Jeltsch, A. Substrate specificity analysis and novel substrates of the protein lysine methyltransferase NSD1. Chemistr., & Biology. 21, 226-237 (2014).
- Obenauer, J. C., Cantley, L. C., Yaffe, M. B. Scansite 2.0: Proteome-wide prediction of cell signaling interactions using short sequence motifs. Nucleic Acids Research. 31, 3635-3641 (2003).
- Takahashi, M., Ueno, A., Mihara, H. Peptide design based on an antibody complementarity-determining region (CDR): construction of porphyrin-binding peptides and their affinity maturation by a combinatorial method. Chemistry. 6, 3196-3203 (2000).
- Kramer, A., et al. Spot synthesis: observations and optimizations. J. Pept. Res. 54, 319-327 (1999).
- Stadler, V., et al. Combinatorial synthesis of peptide arrays with a laser printer. Angew Chem. Int. Ed. Engl. 47, 7132-7135 (2008).
- Schnack, C., Hengerer, B., Gillardon, F. Identification of novel substrates for Cdk5 and new targets for Cdk5 inhibitors using high-density protein microarrays. Proteomics. 8, 1980-1986 (2008).
- Mah, A. S., et al. Substrate specificity analysis of protein kinase complex Dbf2-Mob1 by peptide library and proteome array screening. BMC Biochemistry. 6, 22 (2005).
