En enkel Kritisk store Femoral Defect Model i Mus

Introduction

Det er anslått at halvparten av den amerikanske befolkningen opplever et brudd i en alder av 65 ^1. For pasienter med frakturer behandles kirurgisk, 500.000 prosedyrer innebære bruk av et bein pode ² og dette tallet forventes å stige med en stadig aldrende befolkning ³ . Selv om benet er en av de få organer som har kapasitet til å helbrede fullstendig uten arrdannelse, er det tilfeller hvor prosessen mislykkes ^3,4. Avhengig av omstendighetene og kvaliteten av behandlingen, 2-30% av lange benbrudd svikte, noe som resulterer i ikke-forening ^3,5. Mens det gjenstår en del debatt om definisjonen, pseudoarthrosis, kritiske størrelse eller uorganiserte skader bein generelt refererer til en skade som ikke gror over naturlige levetid av faget ^6. For eksperimentelle formål, er dette varighet forkortet til den gjennomsnittlige tiden som kreves for fullstendig helbredelse av en gjennomsnittlig størrelse bein skade. Uorganiserte benlesjoner oppstå for numerous grunner, men viktige faktorer inkluderer ekstreme traumer som resulterer i en kritisk størrelse gap, infeksjon, dårlig angiogenese, bruk av tobakk, eller hemmet osteoregenerative kapasitet på grunn av sykdom eller alder ^7. Selv om ikke-fagforeninger er vellykket behandlet, kan det koste i overkant av $ 60 000 per prosedyre, avhengig av type skade og tilnærminger ansatt ^åtte.

I moderate tilfeller er autolog bein pode ansatt. Denne strategien innebærer utvinning av bein fra en donor området og implantering på stedet av skader. Selv om denne fremgangsmåte er meget effektiv, er volumet av tilgjengelig donor-avledede ben begrenset, og fremgangsmåten innebærer en ekstra operasjon, noe som resulterer i vedvarende smerte hos mange pasienter ^9,10. I tillegg er effekten av det autologe benimplantat avhengig av tilstanden til pasienten. Bensubstitutter laget av syntetiske materialer eller behandlet avdød bein er rikelig tilgjengelig ^11-13, men de Håve betydelige begrensninger, inkludert fattige host-celle adhesjon egenskaper, redusert osteoconductivity, og potensialet for immun avvisning ^14. Det er derfor et stort behov for bein regenerering teknologier som er trygg, effektiv og allment tilgjengelig.

Evnen til å forbedre ben regenerative strategier er kritisk avhengig av evnen til å etterligne ben alvorlig traume i forsøksdyr, men genereringen og stabiliseringen av store benlesjoner er teknisk utfordrende. I de fleste tilfeller er alvorlig lange ben traumer lignet eksperimentelt ved å etablere en defekt som ikke vil naturligvis gro. Selv om det kan variere med arten ^15, er dette oppnådd ved fullstendig fjerning av et bein segment som er større enn 1,5 ganger diameteren av benet tverrsnitt ^16. Benet blir så stabilisert med et metallimplantat for å opprettholde korrekt orientering av bruddkantene og gir mulighet for mobilitet. På grunn av sin lille størrelse og skjørhetensine lange bein, etablering av slike lesjoner hos mus er utover egenskapene til de fleste forskningsmiljøer. Som sådan, er lang bendefekten modeller begrenset til rotter og større dyr. Likevel mus ga betydelige forsknings fordeler ved at de kan bli genetisk modifisert, og oppdrettet som svekket immunforsvar stammer som ikke avviser humane celler og vev.

For humane celle-baserte applikasjoner, svekket immunforsvar mus er attraktivt å jobbe med fordi de er fysiologisk godt karakterisert, lett å huset, kostnadseffektivt, og enkelt analysert radiologisk og histologisk. Av avgjørende betydning er at svekket immunforsvar mus ikke avvise celler fra forskjellige arter, inkludert mennesker. Den hendige størrelsen gjør det også testing av meget lite antall celler eller volumer av eksperimentelle stillas i ortopediske applikasjoner. Flere murine ortopediske modeller har blitt rapportert at råd til ulike grader av bein stabilitet ^17,18. De systems som resulterer i svært høye nivåer av stabilitet, for eksempel eksterne fixators og låseplater overveiende helbrede ved intramembranøse forbening selv endochondral helbredelse har blitt rapportert ^19. I kontrast til de som tillater en viss mikro- og / eller makro bevegelse, slik som de som anvender ufikserte eller delvis faste medullære pinner, vanligvis helbrede med en overvekt av endochondral ossifikasjon ^20,21. Forsinket union eller uorganiserte defekter av lange ben er spesielt vanskelig å oppnå i mus på grunn av den ekstra stabiliseringsnivå som kreves. Imidlertid er det rapportert en rekke tilnærminger, inkludert medullære pins med sikringsanlegg negler, låseplater og eksterne fixators ^22. Disse systemene generelt fungerer godt, men gitt sin komplisert design de kan være teknisk utfordrende å installere. For eksempel Garcia et al., ²³ utformet en elegant sammenlåsende stiften system for bruk i mus, men fremgangsmåten innebærer innsnitt på to separate reisers og omfattende modifikasjon av femur for å få plass til pinnene. Disse prosedyrer ble utført under et disseksjonsmikroskop.

Heri beskrives en enkel femoral margstiften med en sentral krave utformet for å hindre lukking av en 3 mm ben underskudd og også avgrense de opprinnelige kantene av defekten. Mens pinnen ikke ble festet til benet i seg selv, for å nøyaktig dimensjonering av diameteren stiften og opprømming av marghulen resulterer i tilstrekkelig interferens minimal torsjonsbevegelse (figur 1). Med nøye utvelgelse av innavlet alder, kjønn og stamme matchet mus, er resultatet en svært reproduserbare hypertrofisk ikke-uniondefect ²² som lett kan evalueres radiologisk. Videre regioner av interesse kan reproduserbart definert etter mikro-computertomografi (μCT) for måling av de novo bendannelse og histomorphological parametere. Pinnene ble prototyper i vårt laboratorium ved hjelp av lett tilgjengelige verktøy.

Figur 1: Eksperimentell prinsipp diagrammatisk oppsummering av segmental defekt modell.. Den sentrale 3 mm segment av en 9-10 mm murine femur blir skåret kirurgisk (til venstre). En 3 mm lang, 19 måler kirurgisk stålrøret er ført over en 9 mm lang, 22 G rustfritt stålrør og festes med klebemiddel på den nøyaktige senter (høyre). Den resulterende stiften er montert inn i marg kanalene i de resterende proksimale og distale partier av lårbenet med 19 g kragen å erstatte 3 mm segment av ben (nedenfor midten).

Protocol

MERK: Denne protokollen er laget for kvinnelig naken (Nu / J) mus (18-25 g, 6 uker) kjøpt fra Jackson Laboratories. Siden stammer av mus variere litt i form av anatomi og vekst, anbefaler vi at fabrikasjon av pinnene er optimalisert til belastningen, kjønn og alder av mottakerne før implantering i levende fag. Dersom stammene er nøye avstemt, er presspasning mellom tappen og marghulen meget reproduserbar. Prosedyrer for bolig, kosthold og generell husdyrhold er utenfor rammen av denne protokollen, men alle mus ble plassert i samsvar med Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr ^(8. utgave) og institusjonelle retningslinjer fastsatt av Institutional Animal Care og bruk Committee (IACUC) og Institutt for komparativ medisin (DCM) på Scott and White Hospital.

1. Fabrikasjon av Pins

Figur 2: Pin montering. (A) Fotografier av kirurgisk stål rør ved forskjellige trinn av sammenstillingen, og en 4 mm sylinderdiameter kuttet fra 5 mm tykt ark. Gelfoam (b) etter polering montert tapp (ovenfor), er Gelfoam sylinderen trimmet, plassert over stål kraven (i midten), og deretter autoklavert, noe som resulterer i et sterilt stiften belagt med tørket Gelfoam. Dette forbedrer cellebinding ved skadestedet og opprettholder retningen for helbredelse (nedenfor). (C) En utskåret femur utstyrt med margstiften. (D) Eksempler på pinnesammenstillinger ved forskjellige tykkelser og lengder som viser fleksibiliteten av denne tilnærming. (E) μCT rekonstruksjon av en tapp-stabilisert femorale defekter som illustrerer interaksjonen av marg pin med det trabeklære ben i den proksimale og distale ende av lårbenet.

1. Kutte en lengde på 9 mm 22 G rustfritt hypodermisk rør, og en 3 mm lang 19 G rør ved bruk av en 23,8 mm diameter glassfiberarmert kraftig kappehjul montert på en roterende verktøy. Bruk små fin-kjeve til å immobilisere slangen (Figur 2A, ovenfor). Bruke egnet øyebeskyttelse og håndtere multiverktøy med forsiktighet.
2. Plassere en liten mengde (ca. 10 ul) av cyanoakrylat-lim på midten av akselen 9 mm. Passere 3 mm krage over 9 mm aksling til i sentrum, og vri for å fordele limet mellom kragen og akselen. Måle dimensjoner med et par av digitale målepunkter, og sammenligne med Figur 1. Tillat å sette i minst 15 timer (Figur 2A, senter).
3. Bruk en 220 grit Emery impregnert plate å fjerne ujevnheter og overdreven lim.
4. Ved hjelp av roterende verktøy, polere pinnen ved hjelp av en følte polering plate.
5. Skyll med avionisert vann og tørk med omfatssed luft.
6. Test integritet ved å plassere en 19 G hypodermisk butt nål over akselen av det nylig gjort tappen og presse mot kraven. Sørg for at kragen kan motstå ca 25 g vekt.
7. Skyll stiften i sterilfiltrert fosfatbufret saltvann (figur 2B, øverst). Sikre at skaftet av pinnen passer perfekt inn i lårbens medullær hulrom med krage inntil kantene av kuttet bein (Figur 2C). Prototype ulike konfigurasjoner for bestemte formål av studien og mottaker (figur 2D). Sørge for at endene av tappen trenge inn i det trabeklære ben av diaphysis derved å maksimere fiksering og forbedre presspasning (figur 2E).
   MERK: Det anbefales at passformen er testet på bein eksemplarer før implantasjon i levende mus (f.eks Figur 2C).
8. Bruk en 4 mm diameter punch-biopsi cutter å kutte en sylinderfra et 5 mm tykt ark av gelatin kirurgisk svamp. Bruke en skalpell for å trimme sylinderen til 3 mm lengde og passerer en 20 G kanyle langs lengden av sylinderen for å generere et hull (figur 2A, nedenfor).
   NB: Det er funnet at plassering av en gelatin eller kollagen stillaset på stedet av defekten forbedrer celleansamlinger og induserer lengdevekst langs aksen til benet.
9. Bestå gelatin skumsylinderen over stiften og på linje med kraven (figur 2B, i midten) og autoklaven på en tørr syklus ved 120 ° C ved 15 psi. Gelatin skum vil tørke og mørkere i fargen (figur 2B, nedenfor).

2. kirurgisk teknikk

MERK: Følgende prosedyre er skrevet observere alle retningslinjer fastsatt av Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr ^(8. utgave). Følg også alle ekstra retningslinjenesatt av lokale IACUC og sikre en IACUC-godkjent bruk av dyr protokollen (eller tilsvarende) er på plass før du fortsetter med de neste avsnittene.

Figur 3: Kirurgiske instrumenter. (A) Kirurgisk kit. Micro-drill (1), skjærehjul (2), absorberbare sutur (3), ytre sutur (4), skalpellblader (5), skalpell håndtaket (6), sterile medullære pins innpakket i folie (7), medullær dybdemåler gjort skjema sprøyte rør (8), fine nosed tang (9), rotte-tenner tang (10), sløv rømme nåler (11), nål drivere (12), små hemostats (13), fine saks (14), periostal heis (15), modifiserte Kern tang (16) (B):. Endringer som kreves for å produsere Kern stil bein-grep for mus.

1. Velg et kirurgisk inngrep rom eller ren laboratorium med en lukkbar dør og ingen gjennomgangstrafikk. Sanitize et passende arbeid surface med en klinisk grade kvartær basert desinfeksjonsmiddel renere.
2. Mens iført engangs sterile hansker og kappe, sette opp et sterilt felt på ca 60 x 90 cm ² på den renses arbeidsflaten med autoklaveres klut gardiner.
   MERK: Det er lurt å ha en assistent fjern den ytre emballasjen og presentere de sterile materialer til etterforsker sette opp feltet.
3. Plasser en renovert oppvarming pad montert på et varmt vann re-sirkulasjonspumpe på drapere og dekk med sterile engangsgardiner. Varm en perle sterilisator til driftstemperatur (250-265 ° C, dette tar opptil 30 min).
4. På det sterile feltet, arrangere den kirurgiske kit (figur 3A) for å gi enkel tilgang til alle komponenter. Også tilveiebringe steril bomullsgas (2 x 2 tommer ^2), Q-tips sterile, en steril stålskål (500 ml) inneholdende sterilt saltvann (0,9% w / v), og klorheksidin / isopropylalkohol kirurgisk desinfiserende applikatorer.
5. Montere en litendyr anestesi enhet ved siden av det sterile feltet med en induksjon kammer og nese-membranen i samsvar med veterinær veiledning og bruksanvisningen. Bruke klinisk klasse oksygen som gasstilførselen og isofluran, USP.

Figur 4: Kirurgisk prosedyre. (AC) Approach og eksponering av femur. (DE) Høyde og kutt. (FK) Reaming og dimensjonering av marg kanalene.

Figur 5: Kirurgisk prosedyre. (AB) Installasjon av pinnen. (CD) Closure. (E) Typisk bilde av riktig plassert pin 24 timer etter operasjonen.

6. Plassere en mus i induksjonskammeret av anestesi systemet og for segt utgangen til 2 l min ^-1 O ₂ og isofluran konsentrasjon på 3% (v / v).
   1. Sjekk at musen er bevisstløs innen 1 min; heve konsentrasjonen til 4% (v / v) om nødvendig. Ta av mus, sted på sterile feltet med varmeputen plassert under og bruke nesepartiet. Transfer strømme til kjeglen, og redusere isofluran til 2,5%, vente på en ytterligere 20 sek, og test for tilstrekkelig kirurgisk plan i tråd med institusjonell politikk. Typisk, er mangelen på en baklabb refleks når forsiktig presset tilstrekkelig for å bestemme tilfredsstillende anestesi.
   2. Under hele prosessen, har en assistent monitor for sterk regelmessig pusting og rosa fargen på ekstremitetene og munn regionen for å sikre et passende nivå av oksygene mens bevisstløs. Juster anestesi i samsvar med veterinær veiledning og institusjonell policy om nødvendig. Anvende sterile kunstige tårer smøremiddel salve (15% (v / v) mineralolje, 83% (v / v) white petrolatum) til øynene.
7. Snu musen på den ene siden med bakbenet vendt oppover på en ny engang drapere. Eventuelt fjerne pels med en elektrisk barberhøvel eller hårfjerningskrem. Tørk området med sterilt saltvann og fjerne den ekstra drapere med overflødig pels. Plassere en ny fenestrert drapere over musen, slik som å dekke alle deler, men hele bakbenet (Figur 4A), men opprettholde utsikt over ansiktet og pote å overvåke hårfarging og puste.
8. Isere de proksimale og distale ender av femur og innsnittet i huden etter 5-10 mm langs den langsgående aksen (figur 4B). Separer hudlaget fra fascia med en # 15 skalpell, utsette en lateral tilnærming til femur via biceps femoris og vastus lateralis. Finne hvor septa av både muskler møte (det er en linje med hvit vev mot den rosa fargen på muskelen). Med en skalpell, nøye dissekere langs intermuscular grensen førfemur er synlig (figur 4B).
9. Utvikle snittet med en stump periostal heis, slik som å eksponere hele diaphysis (Figur 4C). Bruke heisen om å avsløre de sentrale To tredjedeler av femur mens du sørger for å bevare den bakre neurovascular bunt på den mediale side (Figur 4D). Forsiktig skrape bløtvev ut av beinet med en skalpell, og tørk av med en steril Q-tip eller tilsvarende.
10. Finn midten av femur med calipers om nødvendig og mark med en steril skalpell eller markør, og deretter markere 1,5 mm proksimalt og distalt fra sentrum. Forsiktig tak femur ved hjelp av et par av fine-nosed tang tidligere fashioned i Kern stil å hindre overdreven press på beinet.
    MERK: Eksakte dimensjoner for modifikasjoner er gitt i figur 3B. Det anbefales å teste tang på en avlives prøven før bruk for å sikre beinet vil ikke bryte under press kreverd for immobilisering under skjæring.
11. Ved hjelp av en fin drill utstyrt med en fin diamant-grus belagt kuttehjul (8 mm diameter x 0,1 mm bredde), gjør det første kuttet med heisen på plass for å beskytte vev under (Figur 4E). Heve kutt femur til 45 ° mens holder fast enden av diaphysis, gjøre andre kutt, fjerne en 3 mm segment.
    MERK: Ansiktsbeskyttelse anbefales på dette stadiet.
12. Med benet immobilisert ved tang, nøye rømme marg hulrom i hver ende med en stump 23 G kanyle. Ved hjelp av en forhåndslaget dybdemåler fremstilt av en lengde på 22 G rør plassert i 19 g røret (figur 3A, i tem 8), vurdere dybden av rømmet marghulen og sikre at det er 3 mm (figur 4F-K) . Hvis marghulen motstår 22 G dybdemåleren, rømme igjen med en sløv 22 G kanyle.
13. Sett forsiktig margpinnen inn i proksimale deretter distal medullær cavities å bringe femur tilbake til sin opprinnelige lengde, og etablere et stabilt 3 mm gap (figur 5A, B). Hvis nødvendig, anvende en liten mengde av manuell belastning for å oppnå en god presspasning av stangen med det kortikale ben av femur. Sikre at tappen passer perfekt inn i marg hulrom begge sider og kantene av cut bein er flush med krage. Hvis det er et gap, rømme gang med en 22 G butt nål.
14. Reposisjonere muskel og perifert vev over stiften og lukke med en kontinuerlig absorberbare 5-0 sutur (figur 5C). Lukk hud snitt med 5-7 firkantet knute nylon 5-0 sting og tetning med kirurgisk lim (Figur 5D).

3. Postoperative Prosedyrer

1. Etter stengetid huden innsnitt, trekke anestesi, men tillate O ₂ å forbli strømmer til musen begynner å bevege seg; dette bør ta mindre enn 1 min. Hvis musen forblir ubevegelig etter 5 min avO ₂ administrasjon, se institusjonelle politikk på veterinær intervensjon.
2. Når musen begynner å bevege seg, forsiktig overføre det til et bur inneholdende fortrinnsvis tørre, autoklaverte sengetøy.
   1. Plassere en iglo-type hekker i hvert bur og musen vil trekke seg inn i det, redusere bevegelse. Sjekk at musen gjen bakbenet mobilitet 5-10 min etter utvinning av bevissthet.
   2. Utføre daglig postoperativ overvåking i samsvar med institusjonelle politikk. Gi gelatinized hydrering og mat på gulvet i buret for de første 5-7 dagene og administrere analgesi og postoperativ overvåking i samsvar med institusjonelt godkjente retningslinjer.
      MERK: Vi forvalter 0,05-0,1 mg kg ^-1 buprenorfin ²⁴ med 0,25 ml saltvann subkutant, to ganger daglig i de første 3 dagene og deretter hvis musen ikke gjenvinne normal verktøyet.
3. Etter den første 24-timers for utvinning, opptre live-animalsk røntgen under anestesi for å visualisere pin plassering (figur 4E). Hvis pinnen er forstuet, vurdere umiddelbar revisjon kirurgi.
4. På dag 7 etter operasjonen, fjerne sting i henhold til anestesi og hus i grupper i henhold til institusjonelle husdyrhold politikk.
5. Etter 2-5 uker, humant avlive dyr i henhold til American Veterinary Medical Association godkjente metoder for aktiv dødshjelp ^25.
   MERK: En intraperitoneal injeksjon av kommersielt tilgjengelig barbiturat-kombinasjon dødshjelp cocktail er effektiv og human, men lokale institusjonelle politikk på aktiv dødshjelp bør følges.
6. Nøye dissekere bort bakbenet ved å utsette den proksimale femur og bekkenet fra den mediale side. Trykk forsiktig felles innover fra den laterale side av lem mens løsne lårbenshodet fra acetabulum (hofteskålen) med en skalpell. Skjær resten av muskel og hud med en skarp skalpell eller mikro-saks, slippehele lem danne bekkenet. Med en skarp to Rongeurs eller tunge saks, klippe den nedre bakbenet (tibia / fibula) ca 5 mm under kneleddet.
   MERK: Det anbefales at alle prøvene er lagret på en identisk måte før analyse.
7. Fjerne hud, men la muskelen på plass. Fiks vevet i 10% bufret formalin tilsatt 10 mM _CaCl2 fiksativ i 1 uke, etterfulgt av lagring i fosfatbufret saltvann tilsatt 10 mM _CaCl2 i opptil 1 måned før avbildning. Utføre fiksering og lagring ved 4 ° C. Alternativt skanne prøver umiddelbart uten fiksering.

4. Analyse av prøver

MERK: Bone healing kan bli vurdert av et bredt spekter av metoder som er utenfor rammen av denne protokollen. Følgende er en metode som vi har lykkes ansatt ved hjelp av en prøve microCT (μCT) imager. Det anbefales at følgende parametere are testet i begynnelsen, deretter optimalisert for de spesielle behovene til prosjektet.

1. Pakk prøven i et tynt lag av plast forsegling film og plasser den vertikalt i instrumentet kammeret. Kontroller at femur er vinkelrett på prøvetrinn under hele undersøkelsen. Sette skanne til følgende parametre; spenning = 29 kV, nåværende = 661 uA, makt = 19 W, bildepikselstørrelse (mikrometer) = 21.00; 360 graders rotasjon = ja; ramme i snitt = på (5); rotasjon trinn (deg) = 1,00, tilfeldig bevegelse = på. Lagre bilder som JPEG-filer i en enkelt destinasjon mappe per scan (f.eks figur 6A).
   MERK: Skanningen skal være komplett i 57 min.
2. Utnytte rekonstruksjon programvare til å generere aksiale bilder basert på følgende parametre; glatting = på (4), forskyvning kompensasjon = på, ring artefakt reduksjon = på (5), bjelke-herdende korreksjon (40%), CS rotasjon (deg) = 0.00. Sett utgang til 2,000-15,000 Hounsfield-enheter. Lagre bilder som JPEG-fileri en enkelt destinasjon mappe per scan.
3. Bruke aksiale bilder og analytisk programvare, definere regionen av interesse (ROI) ved å sette nære og fjerne kanter av den opprinnelige feilen. Oppnå dette ved å velge de delene som omfatter kragen bare. På grunn av at kragen er tykkere enn margpinnen, blir disse delene lett defineres (figur 6B, til venstre). Utelukke kragen fra beregningene ved å tegne en utelukkelse sone rundt det (med en 100 mikrometer margin) og overføring av sonen til hver av seksjonene i ROI (Figur 6B, høyre).
   MERK: Polar treghetsmomenter, 3D rekonstruksjoner og beregninger som volumet av nye bein (figur 6C, D) kan lett oppnås ved hjelp av programvaren.

Representative Results

Mus vanligvis gjenopprette bevissthet og hind-lem mobilitet 5-10 minutter etter tilbaketrekking av anestesi. I løpet av de første fem dagene, er det tilrådelig å huse mus individuelt og innføre miljøberikelse for å hindre overdreven bruk av lem. For dette formålet, igloo-type reir redusere behovet for reir bygg og oppmuntre hvile. Vi har også observert at bestemmelsen av mat og hydrogel på gulvet i buret reduserer sannsynligheten for at pinnen forskyvning. I løpet av fem-dagers periode, bør analgesi administreres som kreves i henhold til institusjonelt-godkjente retningslinjer. Vekttap opp til ca 15% av den opprinnelige preoperativ vekt er mulig i løpet av fem-dagers postoperativ periode. Tjuefire timer etter operasjonen, er røntgenbilder av den berørte lem anbefales å vurdere pin-plassering. Pinnene skal helt inn i de proksimale og distale medullære kanalene med kantene av defekt flush mot kragen (Figur 2C,2E, figur 5E, og figur 6A). I sjeldne tilfeller (<5% av tilfellene), kan pins bli forstuet på tidlige stadier av healing og dyrebruk protokoller bør gi for revisjon kirurgi hvis dette skjer. Mens det er teknisk utfordrende å kvantifisere torsjonsbevegelse på murine lårben, manuell palpasjon av prøvene bekreftet at vridnings og langsgående bevegelse er marginal etter 7 dager som bindevev akkumulerer rundt pinnen. Etter fem dager med postoperativ overvåking, kan musene bli returnert til standard felles bolig som per institusjonelt-godkjente retningslinjer.

Uten terapeutisk intervensjon, kantene av defekten typisk forlenge 0,5 mm i løpet av 21 dager, men i sjeldne tilfeller kan nye bein vekst være opp til 1 mm (figur 6A). Benvekst arrestert etter denne periode som inflammatoriske og anabolske trinn av regenereringen opphører resulterer i en ikke-forening defekt. Etter 14-21 dager med healing, volumet of de novo ben kan lett bestemmes fra aksiale bilder generert av μCT skanning. Ved hjelp av scanning, aksiale gjenoppbygging og ROI seleksjonsprosedyrer er beskrevet i protokollen, volumet av nytt ben som genereres øker med tiden, men generelt ikke overstige en total på 1 mm ³ i fravær av terapeutisk intervensjon (figur 6C), sammenlignet med 6- 7 mm ³ i en anatomisk tilsvarende område av det uskadde femur. Mens konvensjonelle biomekanisk testing er teknisk utfordrende på grunn av prøvestørrelsen og typen av festemetoden, det polare treghetsmoment (PMI), en estimering av materialets evne til å motstå torsjon basert på tverrsnittsarealet og densitet, har vært vist seg å representere en passende estimering av styrke i lange ben ^26,27. Ved hjelp av denne metoden, kan aksiale tverrsnitt på forskjellige avstander fra lesjonen kantene bli valgt for analyse. Etter 21 dager, PMI av de novo bein 0,25 mm from lesjonen kanter varierer fra mellom 0,05 til 0,35 mm ^4, sammenlignet med 0,02 til 0,08 mm ⁴ på midten av lesjonen ytterligere bekrefter tilstedeværelsen av ikke-forening i ubehandlede tilfeller (figur 6D). PMI av uskadde femur på en anatomisk tilsvarende plassering vanligvis varierer mellom 0,5-0,7 mm ⁴ med vilkårene som er beskrevet her.

Figur 6: Typiske resultater. (A) røntgenundersøkelser av lårben på dag 7, 14 og 21 etter operasjonen demonstrere begrenset innvekst av ben Panel B:. Skjematisk fremstilling av ROI parametere for volumetrisk måling av benet. Representative aksiale tverrsnitt med en eksklusjonssone (EX) over tappen krage med en 100 um margin å utelukke måling av gjenstander ved metall-vevet grensesnitt (til venstre). Full bein scan (right, øverst) som viser den langsgående ROI definert av seksjoner av benet mellom kantene av kraven med opprinnelige benvev ekskludert (EX). De opprinnelige lesjon kanter er plassert i de aksielle seksjoner ved hjelp av forskjellen mellom diameteren av tappen, og kragen (høyre, nedenfor). (C) Typiske volumetriske målinger på dag 7, 14 og 21 etter kirurgi uten noen terapeutisk intervensjon (betyr med standardavvik, n = 3). (D) PMI-målinger ved aksialsnitt 0,25 mm fra den proksimale og distale lesjon kantene og midtpunktet (betyr med standardavvik, n = 3). (E) Masson s Trichrome-fargede parafininnleiret seksjon (venstre) kuttet i lengderetningen som viser benet utvekst som består av brusk (ca) og porøst ben (b) (Målestokk = 0,5 mm). Posisjonen av feltet er angitt på X-ray scan (høyre). (F) Ikke-decalcified, metylmetakrylat innebygd koronale delen av en dag gammel defekt farget med hematoxylin og eosin (skala bar = 1,0 mm). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Avkalking av vevet tar vanligvis 10-14 dager ved anvendelse av standard betingelser, og kan lett overvåkes ved røntgen-skanning. Det er lurt å beholde noen muskulaturen på prøvene under avkalking for å forbedre stabiliteten under håndtering. Etter avkalking, kan pins fjernes forsiktig med en skarp skalpell tillater parafin embedding og histologi. Masson sin Trichrome farging av langsgående profiler tillater visualisering av endochondral bein utvekst med en ledende kanten av brusk (ca) etterfulgt av spongiosa (cb) (figur 6E). Mens noen skader vil uunngåelig oppstå under disseksjon, histologisk struktur av beinog bindevev er fortsatt uklart om pinnen er fjernet nøye. Alternativt kan metylmetakrylat innebygging og seksjonering av ikke-demineralisert seksjoner utføres med pinnen på plass (figur 6F).

Discussion

Heri, beskriver vi en enkel metode for å generere en kritisk størrelse pin-stabilisert defekt i murine lårbenet ved anvendelse av standard laboratorieutstyr og veterinær. Mens forsamlingen av pinnene og den kirurgiske prosedyren i seg selv krever øvelse, er det godt innenfor mulighetene til en velt biomedisinsk forsker eller veterinær.

Pinnen er plassert i margkanalen uten ytterligere fiksering, noe som gjør fremgangsmåten mer teknisk gjennomførbar enn de mer kompliserte fremgangsmåter som benytter eksterne feste-midler eller sammenlåsende skruer. Mens noen torsjonsbevegelse kan forekomme i løpet av de tidlige stadier av helbredelse, er dette minimeres ved forsiktig oppmerksomhet til diameteren pin og tilstrekkelig rømming av margkanalen, slik som å oppnå en fast presspasning mellom implantatet og endosteum. Med nøye utvelgelse av innavlet stamme og matching av alder og kjønn, blir fit reproduserbart robust i løpet av få dager. Likevel, with bruk av 3D-trykketeknikker, er det forventet at vridningsbevegelse kan bli ytterligere redusert med mer avanserte versjoner av stiften som innlemme oppruede overflater og / eller piggtilknytningssteder. Den enkle tappen fabrikasjon og tilgjengeligheten av et bredt utvalg av hypodermiske rør størrelser tillater også optimalisering av teknikken for praktisk talt alle voksne innavlet mus, uavhengig av naturlig eller eksperimentell ben fenotype.

Den unike pin-krage utforming tjener to formål: (i) for å hindre avvikende innsnevring av feilen og skader på beinekstremitetene gjennom langsgående glidning, og (ii) å gi landemerker som definerer de opprinnelige kanter av mangelen. Som sådan, volumetriske og PMI-målinger kan gjøres enkelt ved hjelp av en prøve μCT skanner for eksempel en Skyscan 1174. Faktisk tillater denne tilnærmingen et nivå for kvantifisering som ikke er lett oppnås med vanlige ikke-kritiske store brudd teknikker som ofte viser variabel eller poorly definert skader. Mens en μCT enhet er å foretrekke for kvantifisering av healing, evaluering av objektiv vurdering av ortogonale røntgenbilder eller 2D bildeanalyseteknikker kan representere mulige alternativer. På grunn av sin lille størrelse og relativt lavt mineralinnhold, kan murine lemmer lett bli fremstilt for histologi og montert som hele prøver for konvensjonell histomorfometri. Dette avviser prøveuttak ofte står overfor forskere som utfører histomorphometric analyser av store dyr brudd.

I forsøkene som er beskrevet her, helbredelsestiden var relativt kort ved 3 uker, noe som tilsvarer den raske, anabole fase av bentilheling. Deretter er benremodelleringen en svært langsom prosess ^28. Vanligvis, hvis sveisingen ikke er observert etter 4 uker, er lite sannsynlig og etter avtale healing, vi observere svært lite ekstra bein vekst etter 4 uker i dette systemet. Videre møter en 3 mm gap kriteriene for Key et enl. ¹⁶ for en kritisk størrelse defekt og Garcia et al., viste at en spalte så smal som 1,8 mm ikke tilstrekkelig gro etter 10 uker, og dette kan bli forsinket i 15 uker med strippet perikondrium ^23.

Mens størrelsen og skjørhet av deres ben er tilstede alvorlige tekniske utfordringer for ortopedisk forskning, er bruk av mus fordelaktig på flere måter. For eksempel er det en rekke svekket immunforsvar stammer som tillater testing av humane celler og proteiner uten frykt for immunologisk avvisning, og deres lille størrelse reduserer behovet for store mengder av verdifulle eksperimentelle materialer, celler eller forbindelser. Dette er eksemplifisert ved vår siste studie som viser effekten av voksne menneskelige stamceller og deres ekstracellulære proteiner for osteoregeneration ^29. Den relativt korte levetid på mus presentere også mulighet for forskning på aldring ³⁰ og bredt utvalg av innavlede stammer peRMIT studiet av global genotype på healing ^31. Det finnes også en rekke sykdomsmodeller som er lett etableres på mus som for eksempel diabetes og osteoporose ^32,33. Av vesentlig notatet er tilgjengeligheten av mange transgene mus som kan brukes med denne teknikken til å øke vår forståelse av regenerativ benfysiologi under forhold med ekstrem traumer.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pin assembly
Dremel rotary tool	Dremel	8220	or equivalent
Heavy duty cut off wheel	Dremel	420
Surgical tubing 19 G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8LY	OD 1.07 mm, ID 0.889 mm
Surgical tubing 21 G	Small Parts (Amazon)	B000FMZ8YQ	OD 0.82 mm, ID 0.635 mm
Surgical tubing 22 G	Small Parts (Amazon)	B000FMYLZS	OD 0.719 mm, ID 0.502 mm
Surgical tubing 23 G	Small Parts (Amazon)	B000FN0SY0	OD 0.643 mm, ID 0.444 mm
Cyanoacrylate adhesive	Loctite	1365882
Emery disc	Dremel	413
Rubber polishing point	Dremel	462
Felt polishing disc	Dremel	414
Gelatin sponge	Surgifoam/Ethicon	1974
Punch biopsy cutter	Miltex	33-34
Surgery/post-operative
Warm pad and circulator pump	Stryker/Thermocare	TP700, TP700C, TPP722
Coverage quaternary spray	Steris	1429-77
Bead sterilizer	Germinator/CellPoint Scentific	Germinator 500
Anesthesia system	VetEquip Inc	901806 or 901807/901809
Isofluorane anesthetic	VETone/MWI	501017, 502017
Surgical disinfectant	Chloraprep/CareFusion	260449
Surgical tools	Fine Science Tools	various	recommend German made
Face protection	Splash Shield	4505
Rechargable high speed drill	Fine Science Tools	18000-17
Diamond cutting wheel	Strauss Diaiond	361.514.080HP
Absorbable sutures	Covidien	UM-213
Outer sutures	Ethicon	668G	or equivalent
Vetbond	3M	1469SB	or equivalent
Hydration gel	Clear H2O	70-01-1082
Diet gel	Clear H2O	72-01-1062
Buprenorphine	Reckitt and Benckser	12496-0757-01	controlled substance
Mouse igloos	Bio Serv	K3328, 3570,3327
Euthanasia cocktail	Euthasol/Virbac	710101	controlled substance
Analysis
Live animal imager	Orthoscan	FD Pulse	or equivalent
Micro-CT unit and software	Bruker	Skyscan1174	or equivalent
Sealing film/Parafilm M	VWR or Fisher	100501-338, S37441
*Generic sources are suitable for all other items such as gause, drapes, protective clothing, animal care equipment.