बृहतभक्षककोशिका कोलेस्ट्रॉल कमी और के phagocytosis पर उसके प्रभाव<em> क्रिप्टोकोकस neoformans</em
Summary
In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Abstract
Cryptococcosis जीनस क्रिप्टोकोकस की रोगजनक कवक के कारण एक जीवन के लिए खतरा संक्रमण है। संक्रमण गहरी फेफड़ों में दोहराने में सक्षम हैं जो बीजाणुओं, की साँस लेना पर होता है। मैक्रोफेज द्वारा क्रिप्टोकोकस के phagocytosis रोग घातक meningoencephalitis पैदा करने के लिए केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में प्रसार करने के लिए सक्षम है कि तरीकों में से एक है। इसलिए, क्रिप्टोकोकस और मैक्रोफेज के बीच सहयोग के अध्ययन के संक्रमण की प्रगति को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। वर्तमान अध्ययन सी द्वारा बृहतभक्षककोशिका संक्रामकता अध्ययन करने के लिए एक कदम दर कदम प्रोटोकॉल का वर्णन इन विट्रो में neoformans। इस प्रोटोकॉल का प्रयोग, मेजबान रोगज़नक़ बातचीत पर मेजबान स्टेरोल्स की भूमिका का अध्ययन किया जाता है। मिथाइल के विभिन्न सांद्रता – cyclodextrin (एमसीडी) murine जालिका सार्कोमा बृहतभक्षककोशिका की तरह सेल लाइन J774A.1 से कोलेस्ट्रॉल खाली करने के लिए इस्तेमाल किया गया। कोलेस्ट्रॉल कमी की पुष्टि की थी और एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध नही का उपयोग करते हुए दोनों मात्रा निर्धारितई कोलेस्ट्रॉल मात्रा का ठहराव किट और पतली परत क्रोमैटोग्राफी। कोलेस्ट्रॉल समाप्त हो कोशिकाओं Lipopolysacharide (LPS) और इंटरफेरॉन गामा (IFNγ) का उपयोग कर सक्रिय और 1 के एक प्रेरक करने वाली लक्ष्य के अनुपात में एंटीबॉडी opsonized क्रिप्टोकोकस neoformans जंगली प्रकार H99 कोशिकाओं से संक्रमित थे: 1। संक्रमित कोशिकाओं सी के साथ ऊष्मायन के दो घंटे के बाद निगरानी की गई neoformans और उनके phagocytic सूचकांक की गणना की गई। कोलेस्ट्रॉल कमी phagocytic सूचकांक में एक महत्वपूर्ण कमी के परिणामस्वरूप। प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक प्रयोगशाला वातावरण में संक्रमण की प्रक्रिया की दीक्षा नकल और संक्रामकता पर मेजबान लिपिड रचना की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक सुविधाजनक तरीका प्रदान करते हैं।
Introduction
Phagocytosis बाह्य संस्थाओं मेजबान कोशिकाओं से भली भाँति रहे हैं जिसके द्वारा एक प्रक्रिया है। यह रोगजनकों के खिलाफ की रक्षा करने के लिए प्रतिरक्षा प्रणाली के शस्त्रागार में एक महत्वपूर्ण हथियार है, लेकिन इस प्रक्रिया अक्सर internalization और शरीर एक भर में प्रसार के लिए अनुमति देने के लिए रोगजनकों द्वारा विकृत किया जा सकता है। Phagocytosis मेजबान सेल के cytoskeleton की rearrangements के माध्यम से लगाव और घिराव में परिणाम है कि कई संकेत घटनाओं द्वारा मध्यस्थता है। 'पेशेवर' फ़ैगोसाइट लगाव और रोगज़नक़ अपनी चपेट में ले और एक फेगोसोम दो रूप है जो lamellipodia के गठन के लिए संकेत करने के लिए हमलावर रोगज़नक़ की सतह पर opsonins को समझते हैं और बाध्य करने के लिए सक्षम हैं। तथाकथित 'पेशेवर' फ़ैगोसाइट अलावा मैक्रोफेज हैं। मैक्रोफेज सबसे की, बाहर की मांग और बीमारी के कारण एजेंटों को नष्ट करने, क्षतिग्रस्त ऊतकों की मरम्मत, और सूजन मध्यस्थता शामिल है कि सुरक्षात्मक कार्यों के लिए बाहर ले जाने कि अति विशिष्ट कोशिकाओं रहे हैंphagocytosis 1,2 की प्रक्रिया के माध्यम से इन।
क्रिप्टोकोकस neoformans Cryptococcosis के रूप में जाना एक गंभीर बीमारी का कारण बनता है कि रोगजनक खमीर की एक प्रजाति है। क्रिप्टोकोकस बीजाणुओं मेजबान द्वारा साँस और आमतौर पर स्पर्शोन्मुख है कि एक फेफड़े के संक्रमण में परिणाम हैं। यह जोखिम बेहद प्रचलित है कि सोचा है; सर्वेक्षण में उन सभी क्रिप्टोकोकल पोलीसेकेराइड glucuronoxylomannan और अन्य अध्ययनों के लिए एंटीबॉडी था कि क्लिनिक ब्रोंक्स लेबनान अस्पताल सेंटर में पाया बाल चिकित्सा संक्रामक रोगों से 61 बच्चों का एक नमूना है, दोनों मानव इम्यूनो वायरस (एचआईवी) असंक्रमित और संक्रमित वयस्कों 3 में व्यापकता से पता चला है 4। वायुकोशीय मैक्रोफेज सफलतापूर्वक स्पष्ट रोगज़नक़ फेफड़े के संक्रमण के लिए और ज्यादातर मामलों में प्रतिक्रिया की पहली पंक्ति रहे हैं। हालांकि, प्रतिरक्षा में अक्षम व्यक्तियों (जैसे, एचआईवी और एड्स रोगियों) में खमीर मैक्रोफेज भीतर जीवित करने में सक्षम है। इन मेंमामलों, मैक्रोफेज रोगज़नक़ की नकल के लिए एक जगह के रूप में सेवा कर सकते हैं और बीमारी 5 घातक हो जाता है, जहां केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) को इसके प्रसार में मदद कर सकते – 8। 11 – यह मैक्रोफेज भी "ट्रोजन हॉर्स" मॉडल 3,9 के माध्यम से रक्त मस्तिष्क बाधा पार करने के लिए खमीर की मदद करने, तानिका में सीधे खमीर उद्धार हो सकता है कि माना जाता है। इस प्रकार, यह phagocytosis की प्रक्रिया और विशेष रूप से क्रिप्टोकोकल संक्रमण में, यह है कि प्रभावित कारकों को समझने के लिए महत्वपूर्ण है।
15 – अन्य रोगज़नक़ सिस्टम में पिछले काम phagocytosis 12 में खेलने के लिए एक महत्वपूर्ण भूमिका होने के रूप में कोलेस्ट्रॉल का गठन करके कोलेस्ट्रॉल और लिपिड राफ्ट को इंगित करें। कोलेस्ट्रॉल स्तनधारी कोशिकाओं में सबसे प्रचुर मात्रा में लिपिड प्रजाति है और 25 शामिल हैं – स्तनधारी कोशिका झिल्ली 16 का 50%। यह biop नियमन में एक भूमिका निभा पाया गया हैउनकी कठोरता 17 बदलकर झिल्ली की hysical गुण। कोलेस्ट्रॉल और sphingolipids एक साथ लिपिड rafts के रूप में जाना जाता झिल्ली के भीतर लिपिड microdomains के रूप में। 18 – लिपिड राफ्ट caveolae के गठन के साथ ही 16 संकेत के कुछ प्रकार के लिए एक अलग डोमेन उपलब्ध कराने में शामिल होने के लिए पाया गया है। कारण उनके छोटे आकार के कारण, यह vivo में लिपिड rafts के अध्ययन करने के लिए मुश्किल है। लिपिड राफ्ट की भूमिका का अध्ययन करने के लिए एक उपयोगी तरीका में अपने समर्थकों को बदलने के लिए है। मिथाइल-β-cyclodextrin (MβCD) स्तनधारी झिल्ली से कोलेस्ट्रॉल व्यय करना पाया गया है और आमतौर पर लिपिड राफ्ट 18 की भूमिका का अध्ययन करने के लिए प्रयोग किया जाता है कि एक यौगिक है।
इस प्रोटोकॉल में, हम मेजबान कोशिका झिल्ली से कोलेस्ट्रॉल गिरेगा और सी phagocytose के लिए मेजबान कोशिकाओं की क्षमता पर कमी के प्रभाव को यों के लिए एक विधि प्रस्तुत इन विट्रो में neoformans। यह प्रक्रिया सेल संस्कृति techniq का उपयोग करता हैसंक्रमण के लिए एक मॉडल के रूप में सेल लाइन (J774A.1) की तरह एक अमर बृहतभक्षककोशिका पर UES। कोलेस्ट्रॉल कमी स्टेरोल्स के आकार के लिए विशिष्ट एक हाइड्रोफोबिक कोर है और कोलेस्ट्रॉल झिल्ली 19 से बाहर आकर्षित करने के लिए एक सिंक के रूप में कार्य करने में सक्षम है जो MβCD, के लिए जोखिम के द्वारा पूरा किया गया था। कोलेस्ट्रॉल कमी मात्रात्मक एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट का उपयोग और गुणात्मक पतली परत क्रोमैटोग्राफी (टीएलसी) 20 के बाद संशोधित Bligh-डायर लिपिड निकासी का उपयोग कर मापा गया था। । 23 – phagocytosis मैक्रोफेज सक्रिय करने के लिए इंटरफेरॉन γ और lipopolysaccharide के एक कॉकटेल के साथ मिश्रित opsonized खमीर की संस्कृति के साथ सेल लाइन से संक्रमण द्वारा मापा गया था क्रिप्टोकोकस एक glucuronoxylomannan (GXM) एंटीबॉडी 21 का उपयोग कर opsonized गया था। धुंधला हो जाना और माइक्रोस्कोपी प्रयोगों phagocytosis की डिग्री का आकलन करने के लिए कोशिकाओं के दृश्य और phagocytic सूचकांक की गणना के लिए अनुमति दी। इस प्रोटोकॉल के विकास, साथ में ले लीएक शारीरिक प्रक्रिया के साथ लिपिड संरचना में परिवर्तन है कि एकीकृत एक बुनियादी विधि escribes।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के साथ काम करने में यह सी स्तनधारी कोशिकाओं चढ़ाना और opsonizing जब सही कोशिकाओं की गिनती प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है neoformans कोशिकाओं। इस परीक्षण के बीच भिन्नता को कम करता है और एक सटी?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम एनआईएच अनुदान एमडी पी को AI56168, AI71142, AI87541 और AI100631 द्वारा समर्थित किया गया। Maurizio डेल पोएता संक्रामक रोगों में बरोज़ वेलकम अन्वेषक है।
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
| Orbital Shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
| Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
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