Summary

マクロファージコレステロール枯渇との食作用への影響<em>クリプトコックス·ネオフォルマンス</em

Published: December 19, 2014
doi:

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

クリプトコッカス属、クリプトコッカスの病原性真菌によって引き起こされる生命を脅かす感染症である。感染は、肺深部に複製することができる胞子の吸入時に起こる。マクロファージによるクリプトコッカスの食作用は、疾患が致死髄膜脳炎を引き起こす中枢神経系に拡散することができる方法の一つである。したがって、 クリプトコッカスおよびマクロファージとの間の関連の研究では、感染の進行を理解する上で重要である。本研究ではCでマクロファージ感染性を研究するためのステップバイステップのプロトコルについて説明in vitroでのネオフォルマンス 。このプロトコルを使用して、宿主 – 病原体相互作用のホストステロールの役割が検討されている。メチルの異なる濃度 – シクロデキストリン(MCD)は、マウス細網肉腫マクロファージ様細胞株J774A.1からコレステロールを枯渇させるために使用された。コレステロール枯渇を確認し、商業的にご利用でき、両方を用いて定量した電子コレステロール定量キット、薄層クロマトグラフィー。コレステロール枯渇細胞は、リポ多糖(LPS)およびインターフェロンγ(IFNγ)を使用して活性化し、1のエフェクター対標的比での抗体-オプソニンクリプトコックス·ネオフォルマンス 、野生型H99細胞を感染させた:1。感染細胞をC.とのインキュベーションの2時間後にモニターしたネオフォルマンスおよびそれらの食作用指数を算出した。コレステロール枯渇は、食作用指数の有意な減少をもたらした。提示されたプロトコルは、実験室環境での感染過程の開始を模倣し、感染性に対するホスト脂質組成の役割を研究するための便利な方法を提供する。

Introduction

食作用は、細胞外のエンティティは、宿主細胞によって内在化されるプロセスである。これは、病原体に対して防御する免疫系の武器庫で重要な武器ですが、プロセスは、多くの場合、内在化および体1全体に拡散を可能にするために、病原体によって打倒することもできる。食作用は、宿主細胞の細胞骨格の再編成を経由して添付ファイルや飲み込みにつながるいくつかのシグナル伝達事象によって媒介される。 「プロフェッショナル」食細胞が病原体を巻き込むとファゴソーム2を形成し、添付ファイルや葉状仮足の形成のために知らせるために侵入病原体の表面にオプソニンを認識して結合することができる。いわゆる「プロ」食細胞の中では、マクロファージである。マクロファージは、ほとんどの、探し出しおよび疾患を引き起こす物質を排除し、損傷組織を修復し、炎症を媒介含む保護機能を遂行高度に特殊化した細胞である食作用1,2のプロセスを介してこれらの。

クリプトコックス·ネオフォルマンスクリプトコッカスとして知られている重大な疾患を引き起こす病原性酵母の種である。 クリプトコッカス胞子はホストによって吸入され、通常は無症候性である肺感染症につながるされている。これは、露光が極めて一般的であると考えられている。ブロンクス·レバノン病院センターの小児伝染病から61子どものサンプルクリニックは非感染し、感染大人3すべての調査対象者は、クリプトコッカス多糖類glucuronoxylomannanと他の研究に対する抗体を持っていたが、ヒト免疫不全ウイルス(HIV)の両方で有病率を示していることがわかった4。肺胞マクロファージは、肺感染への応答の最初の行であり、ほとんどの場合、成功して病原体をオフにします。しかし、免疫無防備状態の個体( 例えば、HIVおよびAIDS患者)において酵母は、マクロファージ内で生存することがある。これらの中で例は、マクロファージが病原体の複製のためのニッチとしての役割を果たすことができると、疾患を5致命的になり、中枢神経系(CNS)への普及を容易にすることができる– 8。 11 –それは、マクロファージはあっても「トロイの木馬」モデル3,9を経由して、血液脳関門を通過するために酵母を支援し、髄膜に直接酵母を配信することができると考えられている。したがって、食作用のプ​​ロセス、特にクリプトコッカス感染において、それに影響を与える要因を理解することが重要である。

15 –他の病原体システムでの以前の研究は、食作用12でプレーする重要な役割を持つとコレステロールによって形成されたコレステロールと脂質ラフトを指す。コレステロールは、哺乳動物細胞中で最も豊富な脂質種であり、25を含む-哺乳動物の細胞膜16の50%。これは、BIOPの調節に役割を果たすことが見出されている彼らの剛性17を変更することにより、膜のhysical性質。コレステロールおよびスフィンゴ脂質は一緒に脂質ラフトとして知られている膜内の脂質マイクロドメインを形成する。 18 –脂質ラフトは、カベオラの形成、ならびに16シグナリングの特定の種類の単離されたドメインを提供することに関与することが見出されている。サイズが小さいために、それは、生体内で脂質ラフトを研究することは困難である。脂質ラフトの役割を研究するための1つの有用な方法は、それらの成分を変化させることである。メチルβシクロデキストリン(MβCD)は、哺乳動物の膜からコレステロールを枯渇させることが見出されており、一般的に脂質ラフト18の役割を研究するために使用される化合物である。

このプロトコルでは、宿主細胞膜からのコレステロール枯渇およびCを貪食する宿主細胞の能力に枯渇の影響を定量化する方法を提示in vitroでのネオフォルマンス 。この手順は、細胞培養物を利用するtechniq感染のモデルとしての細胞株(J774A.1)のような不死化マクロファージ上のUE。コレステロール枯渇は、ステロールのサイズに固有の疎水性コアを有し、かつコレステロールは、膜19の外に描画するためのシンクとして作用することができるMβCDに曝露することによって達成された。コレステロール枯渇は、市販のキットを用いて定性的に薄層クロマトグラフィー(TLC)20に続く改変ブライ-ダイアー脂質抽出を用いて定量した。 。23 –食作用は、マクロファージを活性化するためのインターフェロンγとリポ多糖のカクテルと混合したオプソニン化酵母の文化を持つ細胞株を感染させることにより測定したクリプトコッカスは glucuronoxylomannan(GXM)抗体21を使用してオプソニン化した。染色および顕微鏡実験は、食作用の程度を評価する細胞の視覚化および食作用指数の計算を可能にした。総合すると、このプロトコルD生理学的過程で脂質組成の変化を統合基本的な方法はescribes。

Protocol

MβCDとJ774A.1細胞の1コレステロール枯渇無菌の生物学的安全キャビネット内で、10%ウシ胎児血清(FBS)および1%を補充したダルベッコ改変イーグル培地(DMEM)200μl中、96ウェル細胞培養プレートにウェルあたり10 5 J774A.1マクロファージ様細胞を播種ペニシリン/ストレプトマイシン(P / S)。 37℃でインキュベートし、5%CO 2 O / N。 細胞単層から培地を除去し、…

Representative Results

コレステロール枯渇 1×PBS対照と比較してアンプレックスレッドコレステロールアッセイキットで、製造業者の指示に従って、プロトコルのステップ1.3で予約された上清の分析は、MβCD処理された試料中のコレステロール濃度の上昇をもたらす。細胞型およびMβCD濃度使用コレステロール枯渇に応じて変化してもよい。 10mMのMβCDで処理J774は、約50%の枯渇が観察された。枯渇…

Discussion

哺乳動物細胞をプレーティングし、C.オプソニン化するとき、このプロトコルでの作業では、正確な細胞数を得ることが重要であるネオフォルマンス細胞 。これは試行間の変動を最小限に抑え、正確な1を確実に:研究を通してエフェクター比に1ターゲットを。これは、手順の間にRTで休んでオプソニン化酵母細胞または処理されたマクロファージ細胞を防ぐために、コレステロ…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この作品は、NIHの助成金MDPにAI56168、AI71142、AI87541及びAI100631によってサポートされていました。マウリツィオ·デルポエタは、感染症にバロウズウェルカム調査官である。

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet Labconco 3460009
J774A.1 cell line ATCC TIB-67 Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus Gibco 10082-147 Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator Fisher Scientific Model # 3530
96-Well culture dish Corning Inc. Costar 3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BioReagents BP3994 Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin Sigma Life Science C4555-10G Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Life Technologies Molecular Probes A12216 All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate Corning Inc. Costar 3603
FilterMax microplate reader Molecular Devices Model F5
TLC Chamber Sigma-Aldrich Z126195-1EA
Chloroform Sigma-Aldrich 650498-4L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-2L-R
TLC Paper Whatman 3030917 Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards 
6-Well Plate Corning Inc. Costar 3506
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Cell Scraper Corning Inc. Costar 3010
Hemocytometer  Hausser Scientific 1490
Centrifuge Beckman Coulter Model Alegra x-30R
Votex Mixer Fisher Scientific 12-812
Balance Mettler Toledo Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette Fisherbrand 13-678-20A
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific Model # SPD2010 
Petroleum Ether Fisher Scientific E139-1 
Diethyl Ether Sigma-Aldrich 309966 
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone Analytical Chromatograhy Millipore 1.11845.0001
Iodine Chips Sigma-Aldrich 376558-50G
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 320501 
Manganese Chloride Sigma-Aldrich 244589
UVP EC3 Imaging System Ultra-Violet Products Ltd. Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish MatTek P35G-1.5-10C www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99) Obtained from Duke University Medical Center
YNB BD 239210 See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide Sigma L4391-1MG Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma Sigma I4777 Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa MP Biomedicals 194591 Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope Zeiss Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images

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Citer Cet Article
Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (94), e52432, doi:10.3791/52432 (2014).

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