Summary

El colesterol de los macrófagos agotamiento y su efecto sobre la fagocitosis de<em> Cryptococcus neoformans</em

Published: December 19, 2014
doi:

Summary

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

Abstract

La criptococosis es una infección potencialmente mortal causada por hongos patógenos del género Cryptococcus. La infección se produce después de la inhalación de las esporas, que son capaces de replicar en el pulmón profundo. La fagocitosis por los macrófagos de Cryptococcus es una de las formas en que la enfermedad es capaz de propagarse en el sistema nervioso central para causar meningoencefalitis letal. Por lo tanto, el estudio de la asociación entre Cryptococcus y macrófagos es importante para entender la progresión de la infección. El presente estudio describe un protocolo de paso a paso para estudiar la infectividad de macrófagos por C. neoformans in vitro. El uso de este protocolo, se estudia el papel de los esteroles de acogida en las interacciones huésped-patógeno. Diferentes concentraciones de metil – ciclodextrina (MCD) se utilizaron para suprimir el colesterol de murino sarcoma retículo-macrófago línea celular J774A.1. El agotamiento de colesterol se confirmó y cuantificó usando tanto un dis comercialmentekit de cuantificación de colesterol e y cromatografía en capa fina. Células de colesterol empobrecido se activaron usando lipopolisacárido (LPS) y el interferón gamma (IFN) y se infectaron con Cryptococcus neoformans anticuerpos opsonizado de tipo salvaje células H99 en una relación de efector a diana de 1: 1. Las células infectadas fueron monitorizados después de 2 h de incubación con C. se calculó neoformans y su índice de fagocitosis. Agotamiento de colesterol dio lugar a una reducción significativa en el índice de fagocitosis. Los protocolos presentados ofrecen un método conveniente para imitar la iniciación del proceso de infección en un entorno de laboratorio y estudiar el papel de la composición de lípidos de acogida sobre la infectividad.

Introduction

La fagocitosis es un proceso por el cual las entidades extracelulares son internalizados por las células huésped. Es un arma clave en el arsenal del sistema inmune para defenderse contra agentes patógenos, pero el proceso a menudo puede ser subvertido por patógenos para permitir la internalización y la difusión a través del cuerpo 1. La fagocitosis está mediada por varios eventos de señalización que resultan en la unión y la inmersión a través de reordenamientos de citoesqueleto de la célula huésped. Fagocitos "profesional" son capaces de reconocer y unirse a opsoninas en la superficie del patógeno invasor a la señal para la unión y la formación de lamelipodios, que sobresalgan del patógeno y formar un fagosoma 2. Entre los llamados fagocitos "profesionales" son los macrófagos. Los macrófagos son células altamente especializadas que realizan funciones de protección que incluyen la búsqueda y eliminación de agentes causantes de enfermedades, la reparación de los tejidos dañados, y la mediación de la inflamación, la mayoría deéstos a través del proceso de la fagocitosis 1,2.

Cryptococcus neoformans es una especie de levadura patógena que causa una enfermedad grave conocida como criptococosis. Cryptococcus esporas son inhaladas por el anfitrión y dan lugar a una infección pulmonar que suele ser asintomática. Se cree que la exposición es muy frecuente; una muestra de 61 niños de las Enfermedades Infecciosas Pediátricas Clínica en el Hospital Centro de Bronx-Lebanon encontró que todos los encuestados tenían anticuerpos contra el polisacárido glucuronoxylomanan criptocócica y otros estudios han demostrado la prevalencia tanto en el virus de inmunodeficiencia humana (VIH) no infectado y adultos infectados 3, 4. Los macrófagos alveolares son la primera línea de la respuesta a la infección pulmonar y en la mayoría de los casos con éxito claro el patógeno. Sin embargo, en individuos inmunodeprimidos (pacientes por ejemplo, VIH y SIDA), la levadura es capaz de sobrevivir dentro de los macrófagos. En estosde los casos, los macrófagos pueden servir como un nicho para la replicación del patógeno y pueden facilitar su difusión en el sistema nervioso central (CNS), donde la enfermedad se vuelve mortal 5-8. Se cree que los macrófagos pueden incluso ofrecer la levadura directamente en las meninges, ayudando a la levadura para cruzar la barrera de sangre del cerebro a través del modelo "caballo de Troya" 3,9 – 11. Por lo tanto, es importante entender el proceso de fagocitosis y los factores que la afectan, especialmente en infecciones por criptococos.

El trabajo previo en otros sistemas de patógenos apuntan a colesterol y lípidos balsas formadas por colesterol como teniendo un papel importante que desempeñar en la fagocitosis 12-15. El colesterol es la especie de lípidos más abundantes en las células de mamífero y comprende 25 – 50% de la membrana de células de mamíferos 16. Se ha encontrado a desempeñar un papel en la modulación de la BIOPpropiedades ÍSICA de membranas cambiando su rigidez 17. El colesterol y esfingolípidos juntos forman microdominios lipídicos dentro de la membrana conocida como balsas lipídicas. Se ha encontrado que las balsas de lípidos estar involucrado en la formación de caveolas, así como proporcionar un dominio aislado para ciertos tipos de señalización 16-18. Debido a su pequeño tamaño, es difícil de estudiar las balsas de lípidos in vivo. Una forma útil para estudiar el papel de las balsas lipídicas es alterar sus electores. Metil-β-ciclodextrina (MβCD) es un compuesto que se ha encontrado para agotar el colesterol de las membranas de mamíferos y se utiliza comúnmente para estudiar el papel de las balsas de lípidos 18.

En este protocolo, se presenta un método para agotar el colesterol de las membranas de la célula huésped y cuantificar el efecto de la disminución en la capacidad de las células huésped para fagocitar C. neoformans in vitro. Este procedimiento hace uso de cultivo celular techniqUES en un macrófago como línea celular inmortalizada (J774A.1) como un modelo para la infección. Agotamiento de colesterol se llevó a cabo por la exposición a MβCD, que tiene un núcleo hidrófobo específico para el tamaño de los esteroles y es capaz de actuar como un sumidero para el colesterol para dibujar hacia fuera de la membrana 19. Agotamiento de colesterol se midió cuantitativamente usando un kit disponible comercialmente y cualitativamente utilizando una extracción de lípidos Bligh-Dyer modificada seguido por cromatografía en capa fina (TLC) 20. . La fagocitosis se midió mediante la infección de la línea celular con un cultivo de levadura opsonizado mezclado con un cóctel de interferón-γ y lipopolisacárido para la activación de los macrófagos Cryptococcus se opsonizó utilizando un glucuronoxylomanan (GXM) de anticuerpos 21-23. Tinción y experimentos de microscopía permitido para la visualización de las células y el cálculo del índice de fagocitosis para evaluar el grado de fagocitosis. En conjunto, este protocolo dEscribes un método básico que integra la alteración de la composición de lípidos con un proceso fisiológico.

Protocol

1. El colesterol agotamiento de las células J774A.1 con MβCD En una cabina de bioseguridad estéril, de semillas 10 5 J774A.1 células de tipo macrófago por pocillo en una placa de cultivo celular de 96 pocillos en 200 l de medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% penicilina / estreptomicina (P / S). Se incuba a 37 ° C y 5% de CO 2 O / N. Retire el medio de la monocapa de células y se lavan las células dos veces con …

Representative Results

El agotamiento Colesterol Análisis del sobrenadante reservado en el paso 1.3 del protocolo, siguiendo las instrucciones del fabricante en el kit de ensayo de colesterol de Amplex Red produce una concentración elevada de colesterol en la muestra MβCD tratado en comparación con el control PBS 1x. Dependiendo del tipo de célula y el agotamiento de colesterol concentración MβCD utilizado puede variar. Para J774 tratados con 10 mM MβCD, se observó una disminución de aproximadamente el 50%….

Discussion

En el trabajo con este protocolo es importante para obtener recuentos de células precisos cuando chapado en células de mamíferos y opsonizantes C. células neoformans. Esto minimiza la variación entre los ensayos y asegura una precisa 1: 1 de destino para la proporción de efector durante todo el estudio. También es fundamental para coordinar la temporización de la depleción de colesterol y para prevenir la infección las células de levadura o células opsonizadas macrófagos tratados de reposo…

Divulgations

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por becas del NIH AI56168, AI71142, AI87541 y AI100631 de MDP. Maurizio Del Poeta es Burroughs Wellcome Investigador en Enfermedades Infecciosas.

Materials

Name of Reagent/ Equipment Company Catalog Number Comments/Description
Class II type A2 Biosafety Cabinet Labconco 3460009
J774A.1 cell line ATCC TIB-67 Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing.
Dulbecco’s Modified Eagle Medium Gibco 11995-065 Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use
HI Fetal Bovine Serum Performance Plus Gibco 10082-147 Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) Gibco 15140-122 Used to suplement DMEM
Isotemp Cell culture incubator Fisher Scientific Model # 3530
96-Well culture dish Corning Inc. Costar 3595
10x Phosphate Buffered Saline Fisher Scientific BioReagents BP3994 Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use.
Methyl-β-Cyclodextrin Sigma Life Science C4555-10G Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations
Orbital Shaker Labline
Amplex Red Cholesterol Assay Kit Life Technologies Molecular Probes A12216 All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions.
96-Well Black Assay plate Corning Inc. Costar 3603
FilterMax microplate reader Molecular Devices Model F5
TLC Chamber Sigma-Aldrich Z126195-1EA
Chloroform Sigma-Aldrich 650498-4L
Methanol Sigma-Aldrich 34860-2L-R
TLC Paper Whatman 3030917 Cut down to size needed for TLC tank
Fume Hood Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards 
6-Well Plate Corning Inc. Costar 3506
Trypsin-EDTA Gibco 25300-054
Cell Scraper Corning Inc. Costar 3010
Hemocytometer  Hausser Scientific 1490
Centrifuge Beckman Coulter Model Alegra x-30R
Votex Mixer Fisher Scientific 12-812
Balance Mettler Toledo Model # MS104S Meaures down to .1 mg
Glass Pasteur Pipette Fisherbrand 13-678-20A
Cholesterol Avanti Polar Lipids 700000
SpeedVac Concentrator Thermo Scientific Model # SPD2010 
Petroleum Ether Fisher Scientific E139-1 
Diethyl Ether Sigma-Aldrich 309966 
Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099
TLC Silica Gel 60 with concentrating zone Analytical Chromatograhy Millipore 1.11845.0001
Iodine Chips Sigma-Aldrich 376558-50G
Sulfuric Acid Sigma-Aldrich 320501 
Manganese Chloride Sigma-Aldrich 244589
UVP EC3 Imaging System Ultra-Violet Products Ltd. Use the Vision Works LS software for densitometry analysis
Glass Bottom Confocal Dish MatTek P35G-1.5-10C www.glassbottomdishes.com
Cryptococcus neoformans (H99) Obtained from Duke University Medical Center
YNB BD 239210 See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L.
Lipopolysaccharide Sigma L4391-1MG Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C.
Interferon gamma Sigma I4777 Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution
Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL
Giemsa MP Biomedicals 194591 Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month.
Microscope Zeiss Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images

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Citer Cet Article
Bryan, A. M., Farnoud, A. M., Mor, V., Del Poeta, M. Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (94), e52432, doi:10.3791/52432 (2014).

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