Cholestérol des macrophages épuisement et ses effets sur la phagocytose des<em> Cryptococcus neoformans</em
Summary
In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.
Abstract
Cryptococcose est une infection mortelle provoquée par des champignons pathogènes du genre Cryptococcus. L'infection se produit lors de l'inhalation de spores, qui sont capables de se répliquer dans le poumon profond. Phagocytose par les macrophages de Cryptococcus est l'un des moyens que la maladie est capable de se propager dans le système nerveux central pour provoquer une méningo-encéphalite mortelle. Par conséquent, l'étude de l'association entre Cryptococcus et macrophages est important de comprendre la progression de l'infection. La présente étude décrit un protocole étape par étape pour étudier macrophages infectiosité par C. neoformans in vitro. En utilisant ce protocole, le rôle des stérols d'accueil sur les interactions hôte-pathogène est étudiée. Différentes concentrations de méthyl – cyclodextrine (MCD) ont été utilisés pour épuiser le cholestérol du réticulum sarcome murin macrophage lignée cellulaire J774A.1. Cholestérol appauvrissement a été confirmée et quantifiée en utilisant à la fois un stock pour le commercee kit cholestérol quantification et chromatographie sur couche mince. cellules de cholestérol appauvri ont été activés à l'aide Lipopolysacharide (LPS) et l'interféron gamma (IFN) et infectés par Cryptococcus neoformans anticorps opsonisé cellules H99 de type sauvage à un rapport effecteur à cible de 1: 1. Les cellules infectées ont été surveillées après 2 h d'incubation avec C. neoformans et leur indice de phagocytose a été calculé. Cholestérol épuisement a entraîné une réduction significative de l'indice phagocytaire. Les protocoles présentés offrent un moyen commode pour imiter l'initiation du processus d'infection dans un environnement de laboratoire et d'étudier le rôle de la composition lipidique de l'hôte dans l'infectivité.
Introduction
La phagocytose est un processus par lequel les entités extracellulaires sont internalisées par des cellules hôtes. Ce est une arme essentielle dans l'arsenal du système immunitaire à se défendre contre les agents pathogènes, mais le processus peut souvent être subverti par des agents pathogènes pour permettre l'internalisation et la diffusion dans tout le corps 1. La phagocytose est médiée par plusieurs événements de signalisation qui se traduisent par l'attachement et l'engloutissement par des réarrangements de cytosquelette de la cellule hôte. Phagocytes «professionnel» sont capables de reconnaître et de se lier à opsonines sur la surface de l'agent pathogène envahisseur signaler pour la fixation et la formation de lamellipodes, qui engloutissent l'agent pathogène et former un phagosome 2. Parmi les phagocytes dits «professionnels» sont des macrophages. Les macrophages sont des cellules hautement spécialisées qui exercent des fonctions de protection qui incluent la recherche et l'élimination des agents pathogènes causant, réparation des tissus endommagés, et médiation de l'inflammation, la plupart desceux-ci par le processus de phagocytose 1,2.
Cryptococcus neoformans est une espèce de levure pathogène qui provoque une maladie grave appelée cryptococcose. spores de Cryptococcus sont inhalées par l'hôte et entraîner une infection pulmonaire qui est généralement asymptomatique. On pense que l'exposition est extrêmement répandue; un échantillon de 61 enfants des maladies infectieuses pédiatriques Clinique du Centre Hospitalier Bronx-Liban a constaté que toutes les personnes interrogées avaient des anticorps à la glucuronoxylomannan de polysaccharide cryptococcose et d'autres études ont montré la prévalence dans les deux virus de l'immunodéficience humaine (VIH) non infecté et les adultes infectés 3, 4. Les macrophages alvéolaires sont la première ligne de la réponse à l'infection pulmonaire et dans la plupart des cas avec succès clairement l'agent pathogène. Cependant, chez les sujets immunodéprimés (patients, par exemple, le VIH et le sida) la levure est capable de survivre dans les macrophages. Dans ceux-cicas, les macrophages peuvent servir un créneau pour la réplication de l'agent pathogène et peuvent faciliter la diffusion du système nerveux central (SNC) où la maladie devient mortelle 5-8. On pense que les macrophages peuvent même livrer la levure directement dans les méninges, aider la levure de traverser la barrière hémato-encéphalique via le modèle de «cheval de Troie» 3,9 – 11. Ainsi, il est important de comprendre le processus de phagocytose et les facteurs qui l'affectent, en particulier dans cryptococcoses.
Les travaux antérieurs dans d'autres systèmes de pathogènes pointer vers cholestérol et de lipides radeaux formés par le cholestérol comme ayant un rôle important à jouer dans la phagocytose 12-15. Le cholestérol est espèces de lipides les plus abondants dans les cellules de mammifère et comprend de 25 à 50% de la membrane 16 cellulaire de mammifère. Il a été trouvé à jouer un rôle dans la modulation de la BIOPPHYSIQUE propriétés des membranes en changeant leur rigidité 17. Le cholestérol et sphingolipides forment ensemble microdomaines lipidiques dans la membrane connu comme radeaux lipidiques. Les radeaux lipidiques ont été trouvés à être impliqué dans la formation des cavéoles, ainsi que de fournir un domaine isolé pour certains types de signalisation 16-18. En raison de leur petite taille, il est difficile d'étudier les radeaux lipidiques in vivo. Une façon utile d'étudier le rôle des radeaux lipidiques est de modifier leurs électeurs. Méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est un composé qui a été trouvé pour réduire le cholestérol des membranes de mammifère et est couramment utilisé pour étudier le rôle des radeaux lipidiques 18.
Dans ce protocole, on présente un procédé pour réduire le cholestérol des membranes de cellules hôtes et de quantifier l'effet de l'épuisement de la capacité des cellules hôtes à phagocyter C. neoformans in vitro. Cette procédure fait appel à des cultures de cellules techniqUES sur un macrophage immortalisé comme la ligne cellulaire (J774A.1) comme un modèle pour l'infection. Cholestérol épuisement a été accomplie par exposition à MβCD, qui a un coeur hydrophobe spécifique à la taille de stérols et est capable d'agir comme un puits pour le cholestérol de tirer hors de la membrane 19. Le cholestérol a été mesurée quantitativement épuisement en utilisant un kit disponible dans le commerce et qualitativement en utilisant une extraction lipidique Bligh-Dyer modifié suivie par chromatographie sur couche mince (CCM) 20. . La phagocytose a été mesurée en infectant la lignée cellulaire avec une culture de levure opsonisé mélangé avec un cocktail d'interféron-γ et le lipopolysaccharide d'activation des macrophages a été Cryptococcus opsonisé en utilisant un anticorps glucuronoxylomannan (GXM) 21-23. La coloration et des expériences de microscopie permis pour la visualisation des cellules et le calcul de l'indice phagocytaire pour évaluer le degré de phagocytose. Pris dans leur ensemble, ce protocole dEscribes une méthode de base qui intègre la modification de la composition lipidique avec un processus physiologique.
Protocol
Representative Results
Discussion
En travaillant avec ce protocole, il est important d'obtenir le nombre de cellules précises lors du placage des cellules de mammifères et opsonisants C. cellules neoformans. Ceci minimise la variation entre essais et assure une précision de 1: une cible de rapport d'effecteur tout au long de l'étude. Il est également essentiel pour coordonner la synchronisation de l'épuisement du cholestérol et de prévenir l'infection des cellules de levure ou des cellules opsonisées de macrophages …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été financé par des subventions du NIH AI56168, AI71142, AI87541 et AI100631 au MDP. Maurizio Del Poeta est Burroughs Wellcome chercheur en maladies infectieuses.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-Cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10mM and 30mM concentrations |
| Orbital Shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC Chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume Hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well Plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell Scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex Mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S Meaures down to .1 mg | |
| Glass Pasteur Pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac Concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum Ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl Ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine Chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric Acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese Chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass Bottom Confocal Dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a Glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1mg/mL stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make .1 mg/mL stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/mL | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve .8 g of Giemsa in 25 mL of Glycerol and heat to 60 °C for 1 hour. Add 25 mL of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
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