Summary
Balığı keratositler eksplantlardan hücre tabakaları hareket eder ve epitel yara iyileşmesi bağlamında toplu hücre göçü mekanizmaları üzerinde çalışılması için bir in vitro model sağlar. Bu protokoller detaylı toplu hücre göçü tahlillerde kullanılmak için primer eksplant kültürleri oluşturmak için etkili bir yoldur.
Abstract
Dolayı eşsiz hareketli özellikleri, balık keratositler eksplant kültürleri, uzun tek hücre göçü mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır ayrışmış. Motilite hızlı oranları, bir dik aktin kablosu ile geniş aktin-zengin lamel, ve nispeten sabit hız ve: eksplant kurulmuş Ancak, bu hücreler de bireysel göç incelemek için cazip bir model keratositler yapmak birçok özellikleri koruyarak, topluca hareket göç yönü. Erken eksplantlarda, toplu göç edenlerin ayrı ayrı göç hücrelerin hızlı bir ara-geçiş modunu belirlenmesinde hücre-hücre yapışıklıklar rolü çalışma sağlar, ve göç iki mod arasında moleküler bağları vurgulamaktadır. Mezenkimal geçiş bir epitel oluşur ve yara iyileşmesi ve enflamasyon ile ilişkili genlerin farklı ifade olarak daha sonraki eksplantlarda Hücreler hızla ve toplu göç etme yeteneklerini kaybederler. Bu nedenle, keratosit eksplantlar deri yara iyileşmesi sırasında görülen ve gen sentezleme değişikliklerin belirli bir programı kapsamında toplu hücre göçü mekanizmaları incelemek için benzersiz bir sistemi temsil edebilir reepithelialization için bir in vitro model olarak hizmet edebilir. Mutant ve transgenik zebra balığı hatlarının çeşitli mevcuttur eksplantlar, farklı genetik geçmişlerde, balık tesis edilmesi için izin verilmiştir. Bu durum, bu süreçler içinde farklı protein rolü benzersiz tepki verebilir. Burada belirtilen protokoller toplu hücre göçü ile ilgili bir çok analizde kullanım için olan bu eksplant kültürleri oluşturulması için kolay ve etkili bir yöntem tarif eder.
Introduction
Hücre hareketi Çalışmaları geleneksel bireysel göç hücreleri üzerinde odaklanmıştır. Balık ve amfibi Eksplantlardan kültürlü keratositler 1-6 yaklaşımları deneysel ve matematiksel modelleme hem de kullanılarak hücre hareketi mekanizmaları incelemek için güçlü bir model sistem olduğu kanıtlanmıştır. Düzgün bir şekil, hız, yön ve korurken bireysel göç hücreleri üzerinde deneysel çalışmalar, hücrelerin hızlı, pürüzsüz kayma hareketi ile destekli olduğunu. Özellikle embriyojenez, yara iyileşmesi, ve metastaz sırasında, hücre-hücre kavşaklar muhafaza Bununla birlikte, in vivo koşullarında, hücreler sık sık birlikte hareket eder. Böylece, toplu hücre göçü, hücre göçü alanında araştırma büyüyen ve giderek daha belirgin bir alandır. Bu hücrelerin toplu göç son zamanlarda 7 tarif edilmiştir ve bunun bir yara iyileşmesi modelinde toplu hücre göçü çalışmak için güçlü bir sistem yapmak birçok benzersiz özelliklere sahiptir.
ove_content "> terazi Anestezi uygulanmış yetişkin bir zebrabalıkları koparılan zaman, bir epitel doku ölçek alt bağlı kalır. hücre kültür ortamı eklenir, bu epitel hücreleri veya keratositler, ölçekli bir toplu birim olarak daha hızlı göç ederler. The, eksplant kültürü hücreleri sağlam bir epitel yeniden kurmak için yatağı bir yaranın geçici matris boyunca olduğu gibi eksplant uzak göç olduğu bir epitel yara iyileşmesi modeli olarak görülebilir. Son veriler göstermektedir bu ex vivo kültür taklit birçok özellikleri olduğunu in vivo yetişkin zebrafish yaranın iyileşmesini. Yara kapatma oranları 8 ex vivo sistemde 7 gözlenen benzer bir göç hızına çevirmek. Ayrıca, bir in vivo yara iyileşme modeli, warfarin ile tedavi hemostaz oranı üzerinde hiçbir etkisi olmadığını göstermektedir hidrokortizon tedavisi bağışıklık yanıtı azaltmak için ise şifa, reepithelialization 8 gecikme değilBurada sunulan protokol birçok biyolojik tahlillerde kullanılmak için tutarlılık ve yeniden üretilebilirlik sağlamak zebra balığı keratosit eksplant kültürleri oluşturulması anlatılmaktadır. Bu eksplant kültürler çeşitli nedenlerle toplu hücre göçü için in vitro model özellikle zorlayıcı. İlk olarak, zebra balığı keratositler eksplant kültürleri oluşturulması saat içinde kullanılan primer hücrelerdir. Bu nedenle, bu hücreler, birincil hücrelerin 9-13 geçişi ile ilişkili morfolojik ve gen ifadesi değişikliklerini geçirmiş değil. İkinci olarak, bu sistem, yaralanma karşısında, mezenkimal tr bir epitel bir parçası olarak, 14 yaralama yanıt olarak reepithelialization çalışma için bir modeli temsil eder vegen ekspresyonunda değişiklikler ve sitoskeletal yeniden düzenlemeler 14,15 ile kanıtlandığı gibi ansition (EMT) işlemi başlatılır. Böylece, işlenmemiş hücrelerde meydana gen ifadesi ve hareketlilik arka plan değişiklikleri ile karakterize ve tedavi değişiklikleri yorumlamak için bir bağlam sağlamak edilmiştir. Ayrıca, balık keratosit ve insan keratinosit işlevsel olarak eşdeğer olan; her ikisi de kendi türlerinin birincil epitelyum hücreleri ve epitel yara iyileşmesinde önemli bir rol oynar. Üçüncü olarak, yetişkin zebrabalıkları melanom ve diğer kanserler 19-21, 8,14 ve doku rejenerasyonu 22-24 iyileşme deri yara dahil olmak üzere insan hastalıklarının 16-18 çeşitli için bir model sistem olarak tanıma kazanıyor.
Bu model, sistemin teknik avantajları eşit zorlayıcı. Mutant ve transgenik hatları giderek artan sayıda kar amacı gütmeyen, merkezi tesisleri mevcuttur. Özellikle, Zebra balığı Mutasyon Projesi (SMN) Wellcome Trust Sanger Enstitüsü Zebra balığı genomunda geni kodlama her protein bir nakavt alel yaratmayı amaçlamaktadır. Şu anda, bu özelliği, 24.088 allel ile, 11892 gen, genomun yaklaşık olarak% 45 mutasyona uğramış. Buna ek olarak, SMN önerilerini kabul ve ücretsiz knock-çıkışları üretecektir. Larva ve ergin zebrabalıkları 25-28 gen demonte son yöntemler transgenik yaklaşımlar sorunlu ya da pratik olduğu için gelişimsel olarak önemli genlerin fonksiyonunu incelemek için esneklik sağlar.
~ 145 mm / saat motilite onların son derece hızlı oranları nedeniyle kısa bir süre kültürlerin 29 kurulmasından sonra, tahliller (genellikle 24 saat ya da daha az) hızla tamamlanabilir. Deneyler hızla tamamlandı ve kültürler, oda sıcaklığında iyi bir video mikroskobu ile ilgili memeli hücre göçü tahlilleri önlenir ile ilgili teknik engeller birkaç büyümesi gibi. Buna ek olarak, araştırma bütçeleri sıkma çağında, zebrafish kolay ve masrafsız korunur.
eksplant yapısı ve davranışları karmaşık. Ölçek çıkarıldığında balık kanama yok gibi, yüzeysel epidermal katmanlar daha fazla ölçek ile kaldırılır olası değildir. Hücrelerinin büyük bir çoğunluğu, bir anti-E-kaderin antikoru 14 leke görüldüğünden ölçekler ilk balık kaldırıldığında keratosit eksplant baskın hücre tipi olduğu görülmektedir. Ayrıca, bağışıklık 14 vimentin boyanma olmaması ile değerlendirildiği gibi, ilk kültür fibroblastların bir kanıt yoktur. Ancak, tekrarlanan ölçekli kaldırılması ile, eksplant sayısız nötrofiller olduğu görülmektedir (Videoyu 1). LPS'ye maruz Biz, büyüklükleri, hızlı bir şekilde hareketliliği ve hücre zarının dışına göçlerine morfolojik gözlemlerine dayanarak nötrofiller gibi bu hücreleri belirledik (veriler gösterilmemiştir). Buna ek olarak, bu hücreler, parlak wit lekenötrofil sitosolik faktörü gibi olan kendi yüzeyi üzerinde bol FcR'yi olduğunu gösterir ikincil IgG antikorları, çeşitli için bir antikor (veriler gösterilmemiştir) h. Çoklu hücre tabakaları eksplant içinde mevcut. Konfokal mikroskopi altında, üstünde, ve hücre keratosit levhalar arasındaki görünür nötrofiller ölçeğin yanında keratositlerin ikiden daha fazla katman için öncü kenarında tek bir tabaka mevcudiyetini ortaya koymaktadır.
Erken zaman noktalarında, ~ 145 mm / saat başlangıç fiyatla eksplantından keratositlerin toplu göç başlatan çok katmanlı eksplant polarize kenarında hücreler. Eksplant tarafından kaplanan alan hızla artar tabaka içinde, gerilim yayılan hücreye giden ve ön kenarın önceden bir azalma oranı. Lider ve takipçi hücreleri arasındaki hızlı dönüşümleri tabaka 7 içinde kendiliğinden oluşan deliklerin oluşumu ve kapatılması sırasında önde gelen kenarında görülmektedir. OlarakEksplant ile başlatılan EMT süreç sac parçaları ve keratositler kendi uzmanlık, hızlı hareketliliği kaybetmek, devam ediyor. Gen ifadesi ve EMT ile uyumlu morfolojik değişiklikler, yara iyileşmesi ve inflamatuar yanıtlar eksplant yaklaşık 10 gün 14 için geçerli kabul ediliyor kültür 7 gün içinde ortaya çıkar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokol laboratuvar hayvanlarının bakımı ve kullanımı için AVMA Hayvan Refahı İlkelerine uygun ve Ortabatı Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.
Anestezi, Ekipman, & Medya 1. Hazırlık
- Ticari deklor ajan (evcil hayvan mağazalarında mevcuttur) veya 24 saat su standı sağlayarak kullanarak musluk suyu yaklaşık 1.5 L Klorsuzlaşmaz. Üç 1 L beher edinin ve su dechlorinated 500 ml her doldurunuz. Herhangi bir prosedür önce balık tutmak için bir ve kurtarma için bir Etiket. Üçüncü bir behere, tricaine metansülfonat, 100 ug / ml eklemek; Bu balık anestezi edilecektir beher olur.
- Kültür ortamı sıcak buzla sığ kabını (RPMI 1640,% 10 FBS (fetal inek serumu), 50 ug / ml gentamisin, 100 ug / ml kanamisin, 25 mM HEPES), oda sıcaklığına kadar, ve temiz kuyumcu cımbız toplamak. Immer tarafından temiz cımbız% 70 etanol ipuçlarını şarkı ve etanol yakmak için izin, bir Bunsen beki geçer.
- 10X büyütme, ya da mikroskop (kişisel tercihinize tamamen bağımlı) diseksiyon - prosedür 2 ile ticari, masa üstü ışıklı büyüteç, büyütme olmadan yapılacaktır karar verin.
2. Eksplantasyon Kültürler kurulması
- Bir tutma beher balık ve yerin istenilen sayıda yakalayın. Anestezi beher tek bir balık aktarın; tek tek balık uyutmak için en iyisidir.
- Balık yüzme ve solungaç hareketi gözlemleyerek anestezi etkilerini izlemek. Anestezi ilerledikçe, solungaç hareketi yavaşlar ve balık kararsız ve sık sık baş aşağı yüzmek olacak; en kısa sürede solungaç hareketi durur gibi anestezi balık düşünün. Bu balığın ölümüne neden olabilir anestezi banyosunda daha uzun süre balık bırakmayın.
- Anestezi beher ve transfer balık kaldırbuz, cımbız tutan eli karşı karşıya kuyruk yatay balık yerleştirerek. Tekniği ile ve eğer deneyimli, birden fazla balık, eksplantlar yapmak şu anda anestezi çanak içinde bir sonraki balık yerleştirerek dikkate kullanılacak.
- Ölçekler kaldırmak için, pozisyon cımbız ölçekte kenarında ucu ile balık paralel. Ölçek balık vücuttan yükseltmesine neden biraz balık yan içine cımbız düz tarafı basın. Doku kültürü çanak cımbız, koparmak, ve (inversiyon olmadan) yer ölçeği kavrayın. Solungaç bölge, yan çizgi, ve yüzgeçleri kaçınarak, (her iki tarafta 6) Büyük bir yetişkin 12 ölçeklerde maksimum kaldırma prosedürü tekrarlayın.
- Kurtarma beher içine balık yerleştirin ve anestezi etkisinden kurtarır sağlamak için monitör. Şu anda, balık bağımsız bir tanka geri aktarılabilir. Balık tam ölçekli rejenerasyonu için izin en az 21 gün süreyle kurtarmak için izin verin.
- Bağlı olarakcam alt çanak başına 6 ölçeklerde - deneysel tasarım, plastik 35 mm doku kültürü ile tedavi çanak başına 20 ölçekler ya da 4 kadar koyun. Ölçekler çanak ölçekler ayırmak için değil şekilde yavaşça ortamı eklemeden önce çanak uymak için izin verin.
NOT: Ortam ilk çanak eklenmeden önce tecrübesi ile, birden fazla balık işlenebilir. - Her 35 mm çanak içine tam ortam (yukarıda 1.2) 1.2 ml ekleyin.
- Tercihen ya da ilave işlem olmadan, istenen zaman süresi için% 5 CO2 içinde 28 ° C 'de eksplant kültürleri inkübe edin. Alternatif olarak, bir ısıtmalı mikroskop sahnede veya video mikroskopi için canlı hücre kültür odası içinde kültürleri kuluçkaya yatmaktadır.
3. aydınlık ve video mikroskobu
- Başlangıçta mikroskop sahneye hücre tabakaları içeren ve Pozisyon yemekleri 4X objektif lens kullanarak odak.
Not: Daha yüksek büyütme deneye bağlı olarak kullanılabilir. Yerini İşaretlemeHer hücre sac ve / veya sahnede çanak yönü yaklaşık aynı yönde levhalar ile zamanla görüntüleri alarak kolaylaştıracaktır. - Her deney protokole göre, çeşitli zaman noktalarında kuvöz ve fotoğraftan yemekleri çıkarın ve yalnızca hareketsiz görüntüler deneysel bir zaman dilimi içinde gerekirse kuvöz içine geri yerleştirin.
- Video mikroskobu yerine getirirken, aşağıdaki dikkat:
- Göç hücre sac videonun süresi için görüş alanında kalacak şekilde görüş alanı içinde ölçek / gelişmekte olan hücre tabakasını yerleştirin.
NOT: Bu hücreler ölçek altında göç nasıl gözlemleyerek biraz tecrübe alabilir. Kısa videolar için, bu uzun videolar için daha endişe azdır. - Kısa zaman dilimlerinde için oda sıcaklığında inkübe edilir. Daha uzun zaman aralıklarında (18 + saat) için, ısıtılmış bir aşama ya da tutulması için bir inkübasyon odası, pH dengesini kullanın ve kültür m buharlaşmasını en aza indirmek içinedium.
- Göç hücre sac videonun süresi için görüş alanında kalacak şekilde görüş alanı içinde ölçek / gelişmekte olan hücre tabakasını yerleştirin.
İmmünofloresan Mikroskopi için 4. Tespit
- Hazırlayın ve 28 ° C ön-sıcak tüm çözümler. , Floresan altında keratosit görüntülemek cam alt 35 mm doku kültür kaplarına kullanılarak yukarıda tarif edildiği gibi eksplant kültürleri büyümesi için. Alternatif olarak, cam haznesi slaytlar kullanın.
- Her bir tabağa 1.1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 0.8 ml ilave edilir. İlk kültür ortamını çıkarmayın. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin.
- Her bir tabağa 1.1x PBS içinde% 4 paraformaldehid, 0.8 ml ilave edilir. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin.
- 1X PBS içinde 0.5 ml% 0.2 Triton X-100 eklenmesi ile dışındaki ligandları ya da dış epitopu Permeabilize hücreler kullanılarak edilmiştir. 5 dakika sonra çözeltinin ayrılması için aspire oda sıcaklığında inkübe edin.
- 1x PBS içinde 0.5 mi% 1 BSA ilave edin ve (4 ° C'de) 1 (oda sıcaklığında) saat veya O / N inkübe edin.
Not: Deneysel koşullara göre, phalloidin bu aşamada eklenebilir. - Inkübasyondan sonra, aspirat çözüm kaldırmak ve antikor boyama ile devam edin. 4 ° C 'de 4 hafta - 3 1x PBS içinde% 1 BSA ve 2 ml - Alternatif olarak, en azından 1 eklenerek kültür kaplarına saklayın.
5. İmmünofloresan Protokolü
- Üreticinin önerilerine göre primer ve sekonder antikor çözümleri hazırlayın.
Not: üretici önerileri mevcut değilse, (1x PBS içinde% 1 BSA içinde), birincil antikor iyi bir başlangıç dilüsyonu 1: poliklonal 500 ve 1: monoklonal antikorlar için 1000; ikincil antikorlar için iyi bir başlangıç dilüsyonu 1: 1000. Sinyal güçlü ve arka bir sorun olup olmadığını sinyal düşük, zayıfsa yüksek üreticinin elde edilen orijinal stokunun bu dilüsyonlarını ayarlayın. - 1x PBS çözeltisi içinde% 1 BSA aspire. Primer antikor solüsyonu, 0.5 ml ilave edilir ve (4 ° C) ya da O / N (oda sıcaklığında) 1 saat süre ile inkübe edilir. Birincil antikor çözeltisini çıkarın yer temiz halinde ve 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü etiketli ve -20 ° C'de dondurun.
Not: Gerekirse bu primer antikor yeniden kullanım için sağlar. - Kaldırma ve her yıkamadan sonra PBS atarak, 1x PBS ile 5 kez - çanak 3 yıkayın.
- Ikinci antikor çözeltisi, 0.5 ml ilave edilir. Arzu edildiği takdirde, bu aşama sırasında (bir üreticinin tavsiye edilen konsantrasyon sonrasında) floresan işaretlenmiş falloidinle ekleyin. (4 ° C'de) ya da O / N (oda sıcaklığında) 1 saat süreyle inkübe edin.
NOT: Kullanımı falloidin floresan etiketli aktin filamentler görselleştirme sağlar; Biz 488-işaretlenmiş falloidinle eden zebra balığı keratositlerde en uygun olduğu bulunmuştur, fakat diğer flüoroforlar kullanılabilir. - Çıkarın ve ikincil antikor çözüm atın.
- Kaldırma ve her yıkamadan sonra PBS atarak, 1x PBS ile 5 kez - çanak 3 yıkayın.
Not: çanak 4 ° C vie tutulamazsa, ışıktan gelen kapalı saklanabilirhemen a; Emin 1x PBS hücreleri ama sıcak RT kurumasına değil emin olmak için saklamadan önce çanak içine ilave edilir olun (20-30 dk), sonra hemen önce bir sonraki adıma geçmeden için PBS kaldırmak. - Çanak içine, deneysel ihtiyaçlarına bağlı olarak, ya da DAPI olmadan, bir montaj orta 3 damla ve oda sıcaklığında 10 dakika bekletin - hazır gözlemlemek için zaman, 2 ekleyin.
NOT: DAPI ile bir ticari olarak temin edilebilen, gliserol tabanlı bir montaj ortamı, ancak diğer montaj ortam da kullanılabilir. Çanak oturup montaj orta 10 dakika izin çanak altından cam lamel kolayca çıkarılmasına olanak. - Inkübasyondan sonra, yavaşça gevşetin ve lamel kaldırmak için çanak tarafta sıkmak. Slayt üzerine, aşağı, hücreler cam slayt üzerine montaj medya ek damla ekleyin ve lamel yerleştirin.
NOT: - 2 gün slayt daha uzun 1 tutulması gerekiyorsa açık tırnak cilası kullanarak slayt lamel sızdırmazlık düşünün. - Bir floresan mikroskop altında slayt gözlemleyin.
NOT: Bizim görüntülerin çoğu petrol daldırma altında 40X veya 63X objektif lens kullanarak alınmıştır, ancak belirli objektif deneysel protokol bağlıdır kullanılır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Şekil 1 'de gösterildiği gibi, keratositlerin yaprak eksplant kültürünü kurma saat içinde ölçek altında dışarı doğru yer değiştiren gözlenebilir. Bazen, toplu göç levha koptuğunu bir bireysel göç keratosit görülebilir. Eksplant önce koparıp olan bir balık kurulmuştur Buna ek olarak, tabaka içinden göç bol nötrofiller bulunmaktadır. Uzun kültür dönemlerde, hücreler gibi keratosit sac parçaları EMT 14 uğrarlar.
sac ilerleme başlangıç hızı çok hızlı olduğunu ancak bu oranın hızla kültürün ilk 48 saat (Şekil 2A-C) sırasında (~ 3.1 sırasıyla kat ~ 1.8 artış alanı ve internükleer mesafe ile ölçülür ve) hücrelerinin yayılmasını yavaşlatır. hızlı bir artış, hücre çoğalması ile ilişkili değildir; (floresan timidin analog etinil deoksiüridin 24 saat etiketleme sonraEdu), ~ hücrelerin% 10 hücre bölünmesi saptanmaktadır, bir oran dönüştürülmüş hücre hatlarında görülen fakat insan organotipik kültürlerinin 30 yeniden epitelizasyon husule içinde bulunan hücreler ile daha tutarlı daha düşüktür. Sonraki zamanlarda, ön kenarının önceden zorlaştırır sac parçaları (bu sistemde 14 gözlenen EMT ile ilişkili bir olgu) ölçmek için.
24 saat sonra, levhalar tarafından kaplanan alan, toplu hücre göçünü 15,31 değiştirmek için bileşiklerin kabiliyeti için hızlı bir ekran olarak kullanılabilir. Tedavi eksplantlar kurulan anda ilave edildiğinde, levha alanındaki bir doz-yanıt görülebilir. Bazı memelilerin sitokinler (örneğin, TGF-1 15) (örneğin, CXCL12 gibi) kemokinler ve küçük molekül inhibitörleri, ilk olarak, memeli sistemlerde, özelliği (örneğin MMP-2, -9 ve -13 inhibitörleri 31) başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Ancak, 24 saat sonra levha alanları normal dağılım gibi (
Bir çok durumda, ortak göç ile tedavi (ler) in etkisi daha kısa zaman süreleri gözlenir. Bu gibi durumlarda, görüntü mikroskopi tedaviye birlikte göç eden tabakanın tepkisini analiz etmek için kullanılabilir. Çözünür RGD içeren peptit kültür ortamı (Şekil 4'te üçüncü panel) çözeltisine ilave edildiğinde, bir bozmayadhesion oluşumu, levha ön kenarında lameller hızla küçülmeye ve levha ayırır ve geri çeker sonradan öncü. Tüm tabakanın en az 2 dakika içinde geri çekilmesi gibi, tedaviye tabakanın karşılık hızlı olabilir.
Şekil 5'te gösterildiği gibi, tabaka içinde veya lider ve izleyici hücreler içinde protein lokalizasyonu değerlendirmek için, tüm yaprak, sabit ve boyandı. Hücre tabakaları kolaylıkla parçalanır olarak bakım sabitleme işlemi esnasında özen gösterilmesi gerekmektedir. Elimizde olanlar, memeli proteinlerinin fonksiyonel alanları çok poliklonal antikorlar (özellikle sitosolik proteinler) bizim zebra balığı eksplantlarında reaksiyona geçmeye tespit edilmiştir.
Şekil 1. Hücre yaprak Toplu göç. Eksplant kültürü kurulmasından sonra, keratositler göçkolektif bir birim olarak ölçek altından. (A), kültür içinde sadece 2 saat sonra ölçek uzağa göç hücrelerin nispi miktarını göstermektedir (BE), her bir saat sonra alındı (3 - sırasıyla 6 saat). Tüm görüntüler 100X büyütmede alınmıştır. Tüm sıra video 1 'de gösterilmiştir; bir kare 6 saat süre boyunca her 30 saniyede alınmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Toplu Göç 2. özellikleri. Önde gelen kenarının önceden başlangıç oranı, birçok noktasında ölçülen hızlıdır, fakat kültürde ilk 24 saat (A) boyunca yavaşlar. C kullanarak internükleer mesafe ve hücre alanının ölçümüultures 4 ° C'de sabit ve 24 saat ve DAPI ve referans olarak falloidinle aynı zaman dönemi boyunca, iki alan olarak ölçüldüğü üzere (her çekirdeğin merkezinden ölçülen) internükleer mesafe ve hücre alanı artar (kortikal aktin kapalı olduğunu göstermektedir lekeli hücre iskeleti, (B) ve (C), sırasıyla). Her grafik, üç kopya halinde, üç bağımsız deneyin ortalamasını (± SEM) temsil eder. Bu rakam Rapanan ark modifiye edilmiştir. 7 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil Toplu Göç 3. Analizi Hücre levha alanı kullanılmıştır. Kültürünün oluşturulması sırasında kültür ortamına ilave edilir, Peptide Z-PLG-NHOH (geniş spektrumlu MMP) ve küçük molekül SB-3CT (MMP2 ve 9 özel) inhibitörleri kültürde 24 saat (A) sonra hücre sac alanını azaltır. (; Işlenmemiş hücre yaprak alanı katlanarak (B) dağıtılmış gibi, veri metinde açıklanan ve mavi (üst referans sınırı veya URL ve alt referans sınırı veya LRL'ye belirtildiği gibi belirlenen medyan standart hata ile medyan olarak çizilen gerekir C)). median ve URL ve LRL'ye arasındaki fark (açık yeşil gölgeli) grafik üzerinde hata çubukları boyutunu belirler. Bu rakam McDonald ve ark modifiye edilmiştir. 31 Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Şekil 5. imüno-flüoresan deneyi. Hücreler MMP14a (kırmızı) katalitik alanı ile bir antikor ile boyanmış ve fluoresan olarak işaretlenmiş (488) falloidinle (yeşil) ve / veya DAPI ile zıt(Mavi). (C) ve (D), tipik bir 24 saat tabakasının bir bölümünü göstermektedir ise (A) ve (B) 'ölçekte ortaya çıkan, tipik bir 4 saat levha temsil eder. Tüm görüntüler 400X büyütmede alınmıştır. MMP14a boyama yoğunluğu lideri hücreleri (A) ve (C)) 'de görülen ön (B (görülür) ve (D)') ortaya çıkan hücre tabakaların kenar ve öne çıkan lamellipodia daha yüksek olduğuna dikkat edin. Burada tıklayın Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
kültür ortamı ilavesinden önce 3 dk - keratosit eksplant kültürünün başarısı için en kritik adım ölçeği yaklaşık 2 için kültür çanak uymak için izin veriyor. Yaklaşık ölçek% 75 yapışır ve (her bir deney için kurulan kültürlerin sayısı buna göre ayarlanması gerekir) yaprak artacak. Keratosit yaprak balık çıkarıldı ve çeşitli nedenlerle kültüre yerleştirilmiştir, her ölçek çevresinde oluşturmazlar. İlk olarak, eksplant DAPI boyama bazı ölçekler birkaç hücre bağlı olduğunu ortaya koymaktadır ve bu nedenle bu ölçekler keratositlerin yaprak olmayacağı beklenmektedir. İkincisi, doku kültürü çanak uymak eksplant yeteneği sac göç için önemli bir ön koşuldur. Kurulan terazi uygun olmadığını bir anahtar belirleyicisi ve başarılı bir eksplant kültürü büyüme yüzeyi ve medyanın yanı sıra ölçeği yerleştirerek arasındaki zamanı. Medya olmadan uymak için yeterli zaman uçuşan ölçekler yol açacaktırçok uzun bir süre (satış kenarında görünür hücre kalıntıları ile eksplant kurumasını tahminen nedeniyle) hiçbir büyüme ile yapışık ölçeklerde neden olurken medyada g (bazen görünür dokusu ile ekli). ölçek kabına yerleştirilmesi ve büyüme ortamı ilave arasında süresi, kurutmadan çanak uygun ne kadar hızlı hücre etkileyebilir laboratuar oda içindeki sıcaklık ve nem gibi faktörleri olarak, deneysel olarak tespit edilmesi için gerekebilir.
Ticari olarak temin edilebilir, zebra balığı spesifik antikorların sayısı artmaktadır rağmen, mevcut reaktifler çeşitli sınırlayıcı olabilir. Imünojen ve hedef proteini arasındaki bir% 85 benzerlik, tipik olarak çapraz reaksiyon için gerekli olarak kabul edilir. Bununla birlikte, bu gibi aktif siteler, protein-protein etkileşim bölgeleri, ve modifikasyon siteleri gibi fonksiyonel alanlar, proteinin diğer bölgeleri daha korunmuş olan bu bölgelere olarak anti-peptid poliklonal antikorlar genellikle olabilirtüm benzerlik düşük olsa bile kullanılır. Kesme yerleri Benzer yüksek 31 muhafaza ederken katalitik ve protein bağlanma bölgeleri olarak% 96 - zebra balığı MMP14a insan ortologunun ile genel olarak% 68 özdeşlik gösteren, ancak, örneğin, 79 kimlik artar kısmını (değeri = 0 beklemek). veri bir antikor, insan MMP14a katalitik olarak aktif siteye yönlendirilmiş olduğunu göstermektedir Zebra balığı kültürleri keratositlerde ile çapraz-reaksiyona girer. Zebra balığı yaprak boyama ön kenarda 31 de gergin hücrelere lokalize olabilir öneri MMP14 mekanik sensör 32 olarak hizmet düşündürmektedir diğer veriler ile tutarlıdır.
Bu steril olmayan akvaryumlar su içinde bir balık bir tamamen steril eksplant oluşturmak mümkün değildir. Bizim deneylerin çoğu 24 saat içinde tamamlanır, biz eksplant bakteriyel veya mantar bulaşma ile hiçbir sorunları yaşayabilirsiniz. Ancak, daha uzun inkübasyon süreleri arzu edildiği takdirde, muhafaza sterilite Of eksplant bir sorun haline gelebilir. Inkübasyon 3 veya daha fazla gün karıştığı bir deney planlarken, çeşitli önlemler kültürleri kirlenmemiş kalması olasılığını artırmak için alınır. İlk olarak, bakteri yükü azaltmak için, taze balık 3 değişiklikler ile ilgili olarak, 1 saat boyunca yüzerek bırakılır veya / ml kanamisin, 100 ug eklenmeden musluk suyu kloru giderilmiş. İkinci olarak, ortam antibiyotik yeterli düzeyde korumak ve mevcut olan herhangi bir bakteri sayısını azaltmak için, günlük olarak değiştirilir. Özellikle uzun inkubasyon için (> 5 gün) 1x PBS ile üç yıkar, her ortam değişimi ile yapılır. Bununla birlikte, bu ortam ile değiştirilmesi gerekir gibi eksplant kültürü eksojen bir bileşik ile muamele edilir, deney tasarımında dikkat edilmesi gereken bir değişkeni devreye sokabilir. Ayrıca, eksplant tarafından salgılanan sitokinler ve büyüme faktörleri her ortam değişimi ile silinecektir. Ancak, hücre sayısı düşük ve medya hacmi olarakTipik keratosit eksplant büyük olduğu, bu etki önemli olmayabilir.
Balık terazi tam 33 yenilemek için 3 hafta gerektirir, biz balık deneylerinde balık zamanı daha önce tekrarlanan kullanım bu süre kurtarmak için izin öneririz. Epitel tabakası reform çok daha hızlı meydana gelmesine rağmen, aynı balık kullanma arasındaki zaman bu uzunluğunu bekleyen balık 34 deri yara iyileşmesi bildirilmiştir sistemik inflamatuvar etkileri için şansını en aza indirir olduğunu tahmin.
Eksplantlar, uzun epitel hücrelerinin davranışını incelemek üzere kullanılmıştır. Balık türlerinin ve amfibi geniş çeşitli Eksplantlarındaki bireysel ve kolektif hücre göçü seviyelerinde 3-6,35-37 benzer hareketli özelliklere sahip. Bu hücreler memeli eksplant daha belirgin farklı hareketli özelliklere sahip ama genel yapısı ve organizasyon benzerlik 8,30,38 yüksek derecede var görünüyor 14 korunması gereken.
Biz bu protokol bize 14 yara iyileşmesi erken aşamalarında modeli birincil hücre eksplantlarındaki zebrabalıkları keratositlerin toplu göç incelemek için izin verdiğini bulduk. Yeni kurulan birincil kültürleri kullanılarak yapılması deneyler seri primer hücre geçişi ya da dönüştürülmüş hücre serilerinin kullanımı ile ilgili sorunları ortadan kaldırır. Eksplantlar kültürleri oluşturulduğunda EMT başlatılır gibi deri yaralarının iyileşmesinde EMT rolünü incelemek için kullanılabilir. Çalışmalarımız bu birincil eksplantlar daha doğru in vivo yaralı epitel tabakası içinde keratositlerin doğal davranışlarını ve göç taklit öneririz. Bu protokol, göç tahlillerinde kullanım için birincil kültürleri kurulması için hem de deney iklimlendirme sonsuz bir dizi gen ve / veya protein ifadesinde bir değişiklik kontrolü için bir temel sağlariyonları. prosedürler, kolay, hızlı, ucuz, tekrarlanabilir ve herhangi bir araştırma kurumunda kullanılmak için uygundur.
Özet olarak, bu teknik, eksplant EMT gören bir yara iyileşmesi modeli kapsamında toplu hücre göçü için hızlı bir deney sağlar. Bir yönlendirme ölçekli çok katmanlı birçok hücre tipinin varlığı, bu ex vivo kültür sisteme karmaşıklık sağlar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Bu eser Araştırma Kolaylaştırma Hibe EEH ve Araştırma Ortabatı Üniversitesi Ofisi ve Intramural Hibe KJL verilen Sponsor Programlar verilen Sağlık Bilimleri Ortabatı University College fonları tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 35 mm Glass Bottom Culture Dishes (Poly-D Lysine Coated) | MatTek | P35GC-1.5-14-C | 1.5 mm thickness is best for coverslip removal. 14 mm diameter provides more culture area. |
| Swiss Jewelers Style Forceps, Integra, Miltex 17-303 | VWR | 21909-460 | We find that narrow, fine forceps work the best for scale removal. |
References
- Burton, K., Park, J. H., Taylor, D. L. Keratocytes generate traction forces in two phases. Molecular Biology of the Cell. 10, 3745-3769 (1999).
- Keren, K., et al. Mechanism of shape determination in motile cells. Nature. 453, 475-480 (2008).
- Lacayo, C. I., et al. Emergence of large-scale cell morphology and movement from local actin filament growth dynamics. PLOS Biology. 5, 233 (2007).
- Lee, J., Ishihara, A., Theriot, J. A., Jacobson, K. Principles of locomotion for simple-shaped cells. Nature. 362, 167-171 (1993).
- Kolega, J.
- Kolega, J. Effects of mechanical tension on protrusive activity and microfilament and intermediate filament organization in an epidermal epithelium moving in culture. The Journal of Cell Biology. 102, 1400-1411 (1986).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. Collective cell migration of primary zebrafish keratocytes. Experimental Cell Research. 326, 155-165 (2014).
- Richardson, R., et al. Adult Zebrafish as a Model System for Cutaneous Wound-Healing Research. Journal of Investigative Dermatology. 133, 1655-1665 (2013).
- Cheon, H., et al. Increased expression of pro-inflammatory cytokines and metalloproteinase-1 by TGF-b1 in synovial fibroblasts from rheumatoid arthritis and normal individuals. Clinica., & Experimental Immunology. 127, 547-552 (2002).
- Sandeman, S. R., Faragher, R. G. A., Allen, M. C. A., Liu, C., Lloyd, A. W. Does MMP-2 expression and secretion change with increasing serial passage of keratocytes in culture. Mechanisms of Ageing and Development. 122, 157-167 (2001).
- Schnaper, H. W., et al. Increased expression of extracellular matrix proteins and decreased expression of matrix proteases after serial passage of glomerular mesangial cells. Journal of Cell Science. 109, 2521-2528 (1996).
- Tondreau, T., et al. In vitro study of matrix metalloproteinase/tissue inhibitor of metalloproteinase production by mesenchymal stromal cells in response to inflammatory cytokines: the role of their migration in injured tissues. Cytotherapy. 11, 559-569 (2009).
- Zimmermann, T., et al. Isolation and characterization of rheumatoid arthritis synovial fibroblasts from primary culture - primary culture cells markedly differ from fourth-passage cells. Arthritis Research. 3, 72-76 (2001).
- McDonald, T. M., et al. Zebrafish keratocyte explant cultures as a wound healing model system: differential gene expressio., & morphological changes support epithelial–mesenchymal transition. Experimental Cell Research. 319, 1815-1827 (2013).
- Tan, B., Pascual, A., de Beus, A., Cooper, K., Hull, E. TGFb (transforming growth factor b) and keratocyte motility in 24-hour zebrafish explant cultures. Cell Biology International. 35, 1131-1139 (2011).
- Barut, B. A., Zon, L. I. Realizing the potential of zebrafish as a model for human disease. Physiological Genomics. 2, 49-51 (2000).
- Lieschke, G. J., Currie, P. D. Animal models of human disease: zebrafish swim into view. Nature Reviews Genetics. 8, 353-367 (2007).
- Santoriello, C., Zon, L. I. Hooked! Modeling human disease in zebrafish. The Journal of Clinical Investigation. 122, 2337-2343 (2012).
- Etchin, J., Kanki, J. P., Look, A. T. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., Detric, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 309-337 (2011).
- Li, P., White, R. M., Zon, L. I. Methods in Cell Biology. Westerfield, M., White, H. W., Zon, L. I. 105, Academic Press. 403-417 (2011).
- Yen, J., et al. The genetic heterogeneity and mutational burden of engineered melanomas in zebrafish models. Genome Biology. 14, R113 (2013).
- Bouzaffour, M., Dufourcq, P., Lecaudey, V., Haas, P., Vriz, S. Fgf and Sdf-1 Pathways Interact during Zebrafish Fin Regeneration. PLoS One. 4, e5824 (2009).
- Dufourcq, P., Vriz, S. The chemokine SDF-1 regulates blastema formation during zebrafish fin regeneration. Development Genes and Evolution. 216, 635-639 (2006).
- Lee, Y., Grill, S., Sanchez, A., Murphy-Ryan, M., Poss, K. D. Fgf signaling instructs position-dependent growth rate during zebrafish fin regeneration. Development. 132, 5173-5183 (2005).
- Hyde, D. R., Godwin, A. R., Thummel, R. In vivo Electroporation of Morpholinos into the Regenerating Adult Zebrafish Tail Fin. Journal of Visualized Experiments. 61, e3632 (2012).
- Kizil, C., Iltzsche, A., Kaslin, J., Brand, M. Micromanipulation of Gene Expression in the Adult Zebrafish Brain Using Cerebroventricular Microinjection of Morpholino Oligonucleotides. Journal of Visualized Experiments. 75, e50415 (2013).
- Konantz, J., Antos, C. L. Reverse Genetic Morpholino Approach Using Cardiac Ventricular Injection to Transfect Multiple Difficult-to-target Tissues in the Zebrafish Larva. Journal of Visualized Experiments. 88, e51595 (2014).
- Rambabu, K. M., Rao, S. H., Rao, N. M. Efficient expression of transgenes in adult zebrafish by electroporation. BMC Biotechnology. 5, 29 (2005).
- Rapanan, J. L., Cooper, K. E., Leyva, K. J., Hull, E. E. During collective migration, leader keratocytes generate tension in sheet and may become follower or individually migrating cells. Experimental Cell Research. In press, (2014).
- Safferling, K., et al. Wound healing revised: A novel reepithelialization mechanism revealed by in vitro and in silico models). The Journal of Cell Biology. 203, 691-709 (2013).
- McDonald, T. M., et al. Matrix metalloproteinases and collective cell migration in 24 primary zebrafish explant cultures: MMP13 plays an inhibitory role and MMP14 may respond to stretch during reepithelialisation. Cell Biology International Reports. 20, 24-36 (2013).
- Haage, A., Nam, D. H., Ge, X., Schneider, I. C. Matrix metalloproteinase-14 is a mechanically regulated activator of secreted MMPs and invasion. Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2014).
- Sire, J. -Y., Girondot, M., Babiar, O. Marking zebrafish, Danio rerio (cyprinidae), using scale regeneration. The Journal of Experimental Zoology. 286, 297-304 (2000).
- Xu, Z., et al. Teleost skin, an ancient mucosal surface that elicits gut-like immune responses. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110, 13097-13102 (2013).
- Keren, K., Yam, P. T., Kinkhabwala, A., Mogilner, A., Theriot, J. A. Intracellular fluid flow in rapidly moving cells. Nature Cell Biology. 11, 1219-1224 (2009).
- Bereiter-Hahn, J., Strohmeier, R., Kunzenbacher, I., Beck, K., Voth, M. Locomotion of Xenopus epidermis cells in primary culture. Journal of Cell Science. 52, 289-311 (1981).
- Nishikawa, A., Shimizu-Nishikawa, K., Miller, L. Isolation, characterization, and in vitro culture of larval and adult epidermal cells of the frog Xenopus laevis. In Vitro Cellula., & Developmental Biology. 26, 1128-1134 (1990).
- Schober, M., et al. Focal adhesion kinase modulates tension signaling to control actin and focal adhesion dynamics. The Journal of Cell Biology. 176, 667-680 (2007).
