एक फ्लोरोसेंट क्लीयरेंस परख का उपयोग Zebrafish गुर्दे समारोह का मूल्यांकन
Summary
zebrafish क्रोनिक किडनी रोग (सीकेडी) मॉडल के लिए एक लोकप्रिय उपकरण है। हालांकि, उनके छोटे आकार का यह असंभव पारंपरिक तरीकों का उपयोग गुर्दे समारोह का मूल्यांकन करने के लिए बनाता है। हम सीकेडी में zebrafish गुर्दे समारोह के मात्रात्मक विश्लेषण की अनुमति देता है कि एक फ्लोरोसेंट रंजक गुर्दे की निकासी परख एक वर्णन।
Abstract
zebrafish भ्रूण जीवोत्पत्ति के अध्ययन और मानव आनुवंशिक रोग मॉडल के लिए एक विनयशील मॉडल प्रदान करता है। उसके रिश्तेदार सादगी के बावजूद, zebrafish गुर्दे विकसित और मनुष्य के रूप में लगभग एक ही तरह से काम करता है। मानव गुर्दे के निर्माण में एक बड़ा अंतर केवल दो है कि zebrafish की तुलना में नेफ्रॉन के लाखों लोगों की उपस्थिति है। हालांकि, बुनियादी कार्यात्मक इकाइयों में इस तरह के एक जटिल प्रणाली को सरल बनाने के गुर्दे विकसित और कैसे संचालित की हमारी समझ सहायता प्राप्त है। Zebrafish में, ग्लोमेर्युल्स स्थित midline के क्लोअका में एक दूसरे के लिए fusing से पहले भ्रूण अक्ष नीचे द्विपक्षीय चलाने के लिए हट जाना कि दो pronephric नलिकाओं में प्रारंभिक रक्त को छानने का काम के लिए जिम्मेदार है। pronephric नलिकाओं भारी अंत में क्लोअका 2-4 के माध्यम से बाहर निकलने से पहले विभिन्न विलेय के आदान प्रदान के लिए अनुमति देता है, खंडों छोटी नली के साथ छानना की आवाजाही की सुविधा है कि गतिशील सिलिया द्वारा बसा रहे हैं। सीकेडी, इंक के लिए जिम्मेदार कई जीनोंciliogenesis से संबंधित उन luding, zebrafish 5 में अध्ययन किया गया है। हालांकि, एक प्रमुख आकर्षण वापस आनुवंशिक हेरफेर के बाद zebrafish गुर्दे समारोह का मूल्यांकन करने में कठिनाई हो गया है। मनुष्य के कारण मुख्य रूप से उनके जलीय पर्यावरण और छोटे आकार के, zebrafish गैर translational को साबित कर दिया है में पारंपरिक assays के गुर्दा रोग को मापने के लिए। उदाहरण के लिए, यह भ्रूण यूरिया और क्रिएटिनिन सामग्री के विश्लेषण के लिए मछली का मंचन से वे बहुत छोटे हैं, के रूप में खून निकालने के लिए शारीरिक रूप से संभव नहीं है। इसके अलावा, zebrafish अक्सर प्रारंभिक रोगी परीक्षाओं के दौरान किया जाता है जो एक साधारण प्रोटीनमेह 'डिपस्टिक', पर परीक्षण के लिए पर्याप्त मूत्र का उत्पादन नहीं करते। हम गुर्दे समारोह 1,6-9 के बाहर एक पढ़ने देने के लिए, वाहिका संरचना से और बाहर गुर्दे के माध्यम से, मात्रात्मक समय के साथ, एक फ्लोरोसेंट डाई की निकासी की निगरानी के लिए zebrafish के ऑप्टिकल पारदर्शिता इस्तेमाल करता है कि एक फ्लोरोसेंट परख का वर्णन है।
Introduction
मानव गुर्दे रक्त से चयापचय अपशिष्ट छानने और सेलुलर homeostasis को बनाए रखने के लिए आवश्यक विलेय उबरने में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है। गुर्दा रोग का कारण है कि मानव आनुवंशिक रोगों के एक नंबर रहे हैं। सबसे आम विरासत गुर्दे की बीमारी गुरदे नलिकाओं के भीतर तरल पदार्थ भरा थैलियों के विकास के द्वारा होती ऑटोसोमल प्रमुख पॉलीसिस्टिक गुर्दा रोग (ADPKD) है; cystogenesis की वजह से नुकसान गुर्दे समारोह 10 के लिए हानिकारक है। 800-1: ADPKD एक की एक घटना है 1000 और 8 के लिए खातों – अंत मंच वृक्क विफलता (ESRF) 11 में रोगियों का 10%। कई जीनों लगभग 85% और क्रमशः 12,13 मामलों के 15% के लिए लेखांकन, polycystin -1 (PKD1) और -2 (PKD2) सहित ADPKD पैदा करने के लिए फंसाया गया है। इसके अलावा, जीन PKD1 के लिए उत्पादों और -2 पपनी करने के लिए स्थानीय बनाना और ciliogenesis 14,15 के लिए मौलिक हैं। के रूप में जाना मानव आनुवंशिक विकारों की एक मान्यता प्राप्त परिवार अब भी हैसिलिया कार्य प्रभावित और सीकेडी 16 में जो परिणाम ciliopathies,।
सिलिअरी विकास और समारोह को प्रभावित मानव आनुवंशिक रोगों की बढ़ती संख्या इस बार माना बाक़ी organelle में वैश्विक ब्याज आ रहा है। पपनी, एक बाल की तरह सेलुलर फलाव, रिसेप्टर्स और चाबी सेल संकेत घटनाओं के पारगमन के लिए आवश्यक आयन चैनल के साथ समृद्ध है। पपनी आम तौर पर साथ या स्वेटर सूक्ष्मनलिकाएं के एक केंद्रीय जोड़ी के बिना नौ त्रिज्यात व्यवस्था की सूक्ष्मनलिका दोहरी में संरचित एक सूक्ष्मनलिका आधारित axoneme, के होते हैं। axonemal संरचना सिलिअरी कार्रवाई के प्रकार और विधा को परिभाषित करता है। 9 + 2 के सूक्ष्मनलिका व्यवस्था यह उपकला सतहों के पार तरल पदार्थ के आंदोलन में उपयोग किया जाता है, जहां पपनी को गतिशीलता प्रदान करता है। 9 + 0 विन्यास गैर गतिशील है, लेकिन सेलुलर संकेत घटनाओं में 17 में मुख्य रूप से कार्य करने के लिए माना जाता है। इसके अलावा सीकेडी से, सिलिअरी शिथिलता के परिणामों विशेषता का एक सेट है, मोटापा, रेटिना अध: पतन, polydactyly, और संज्ञानात्मक हानि 16 शामिल है कि ciliopathy सुविधाओं। हालांकि, सीकेडी रोगी के जीवन की गुणवत्ता के लिए सबसे अधिक हानिकारक है और इसलिए सिलिअरी संबंधित सीकेडी के लिए विवो मॉडल में उपयुक्त के विकास के पीछे एक प्रमुख प्रेरक बल के बीच है।
zebrafish मानव आनुवंशिक रोग के एटियलजि को समझने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल है। उनका त्वरित विकास, अंडे की बड़ी संख्या है, पारदर्शी ऊतक, और पूर्व utero विकास के उत्पादन के लिए zebrafish विकास की प्रक्रिया कल्पना और जैविक घटनाओं में काफी आसानी के साथ छेड़छाड़ किए जाने की अनुमति देता है। जीन आनुवांशिक रूप से, जीनोम संपादन उपकरण (CRISPR 18 और TALENS 19) की हाल की सफलता का उपयोग कर बदल antisense morpholino प्रौद्योगिकी 20 का उपयोग कर नीचे गिरा दिया, या औषधीय उनके जलीय पर्यावरण के लिए यौगिकों के अलावा द्वारा विनियमित किया जा सकता है। दरअसल, zebrafish ई शुरू करने के लिए एक मंच प्रदान करते हैंअन्य पशु मॉडल में अनुमोदक नहीं कर रहे हैं कि xperiments। Zebrafish whilst वे मनुष्यों के साथ आम में कई कार्यात्मक संरक्षित अंगों, जीन, और संकेत प्रक्रियाओं शेयर (मनुष्यों की तुलना में) अपेक्षाकृत सरल रीढ़ हैं। उदाहरण के लिए, zebrafish गुर्दे मनुष्य 21,22 की तुलना में संरचना और समारोह में उल्लेखनीय समान है। हालांकि, चरणों की एक उत्तराधिकार के माध्यम से विकसित करता है कि स्तनधारी गुर्दे के विपरीत, प्रत्येक एक और अधिक विकसित गुर्दे (pronephros, mesonephros, और metanephros) द्वारा चिह्नित, भ्रूण zebrafish केवल एक pronephros, एक गुर्दा के सबसे अपरिपक्व फार्म विकसित करता है। नेफ्रॉन के लाखों स्तनधारी गुर्दे की इमारत ब्लॉकों के गठन पाया जा सकता है, whilst zebrafish भ्रूण केवल दो के पास है। प्रारंभिक रक्त छानना के लिए अनुमति देते हैं, जो ग्लोमेरुली, महाधमनी के midline के सिर्फ उदर में जुड़े हुए हैं। क्लोअका के माध्यम से बाहर निकलने के लिए पूर्व fusing, अक्ष के साथ दुमदारी चलने वाले pronephric नलिकाओं में ग्लोमेरुली के माध्यम से रक्त फिल्टर। pronephric टीयूbules भारी दुम बाहर निकलें 3,4 की ओर छानना के प्रवाह के लिए अनुमोदक हैं कि गतिशील सिलिया के साथ रोमक कर रहे हैं। यह सरल pronephric संरचना वे अंततः एक अधिक जटिल mesonephros संरचना 21 में विकसित जहां लार्वा विकास के कई हफ्तों के माध्यम से zebrafish homeostasis को बनाए रखता है। हालांकि, zebrafish एक metanephros 21 विकसित करता है कभी नहीं। Zebrafish idiosyncrasies के बावजूद, zebrafish नेफ्रॉन स्तनधारियों में मनाया बराबर जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के साथ खंडित है और इस तरह nephrogenesis 3,22 के लिए vivo मॉडल में एक बेजोड़ प्रदान करता है।
नियमित रूप से मरीजों के रक्त और मूत्र परीक्षण की एक श्रृंखला के माध्यम से गुर्दे समारोह के लिए परीक्षण कर रहे हैं। आमतौर पर रक्त भंग लवण, यूरिया और क्रिएटिनिन के लिए विश्लेषण किया है। यूरिया, क्रिएटिनिन और असामान्य नमक सांद्रता के उच्च स्तर गुर्दे समारोह के साथ समस्याओं का संकेत कर रहे हैं। एक वर्णमिति डिपस्टिक का उपयोग कर urinalysis प्रोटीन, Bloo के असामान्य स्तर का पता लगाता हैडी, मवाद, बैक्टीरिया और मूत्र के नमूने में चीनी मौजूद। रक्त की 10 मिलीलीटर – इस तरह के परीक्षण में सामान्य रूप से मूत्र की लगभग 30 मिलीलीटर या 5 की आवश्यकता होती है। यह मुख्य रूप से की वजह से परख करने के लिए पर्याप्त रक्त या मूत्र इकट्ठा करने का असंभव प्रकृति के कारण, ऐसे zebrafish के रूप में vivo मॉडल जीवों में छोटा करने के लिए assays के इन प्रकार अनुवाद करने के लिए मुश्किल हो गया है। यहाँ, हम उचित zebrafish गुर्दे समारोह परीक्षण की कमी को संबोधित करने और अपने अध्ययन के लिए एक नवीन तकनीक का वर्णन है। रक्त प्रवाह में एक फ्लोरोसेंट डाई इंजेक्शन द्वारा हम गुर्दे के माध्यम से रक्त से निस्पंदन और फ्लोरोसेंट गतिविधि के उत्सर्जन पर नजर रखने और अलग-अलग समय के साथ यों करने में सक्षम हैं। इस विधि को हम का एक उदाहरण प्रदान जो बीमारी की वजह से गुर्दे की क्षति, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafish मानव आनुवंशिक रोग मॉडल के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान करते हैं, vivo में अनुसंधान के लिए एक वैज्ञानिक साधन के रूप में उनके उपयोग गुर्दे सहित कई जैविक प्रणालियों की आनुवंशिक टूटने के विस्तृत अध?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jaipreet Bharj द्वारा प्रदान की तकनीकी सहायता। इस काम में यूरोपीय संघ-FP7 (SYSCILIA -241,955) और डच किडनी फाउंडेशन (CP11.18) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
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