Evaluación del pez cebra función renal mediante un ensayo de Liquidación fluorescente
Summary
El pez cebra es una herramienta popular para modelar la enfermedad renal crónica (ERC). Sin embargo, su pequeño tamaño hace que sea imposible para evaluar la función renal utilizando métodos tradicionales. Se describe un ensayo de aclaramiento renal tinte fluorescente 1 que permite el análisis cuantitativo de la función renal pez cebra en la ERC.
Abstract
El embrión de pez cebra ofrece un modelo manejable para estudiar la organogénesis y modelar enfermedades genéticas humanas. A pesar de su relativa simplicidad, el riñón pez cebra se desarrolla y funciona casi de la misma forma que los humanos. Una diferencia importante en la construcción del riñón humano es la presencia de millones de nefronas en comparación con el pez cebra que tiene sólo dos. Sin embargo, la simplificación de un sistema tan complejo en unidades funcionales básicos ha ayudado a nuestra comprensión de cómo se desarrolla el riñón y opera. En el pez cebra, la línea media situada glomérulo es el responsable de la filtración de la sangre inicial en dos túbulos pronéfricos que divergen para funcionar bilateralmente por el eje embrionario antes de fundirse entre sí en la cloaca. Los túbulos pronéfricos están densamente poblados por cilios móviles que facilitan el movimiento de filtrado a lo largo del túbulo segmentada, lo que permite el intercambio de varios solutos antes de finalmente salir a través de la cloaca 2-4. Muchos de los genes responsables de la enfermedad renal crónica, incLuding los relacionados con ciliogenesis, han sido estudiados en el pez cebra 5. Sin embargo, un gran inconveniente ha sido la dificultad para evaluar la función renal pez cebra después de la manipulación genética. Ensayos tradicionales para medir la disfunción renal en humanos han demostrado no traslacional para el pez cebra, debido principalmente a su medio acuático y pequeño tamaño. Por ejemplo, no es físicamente posible extraer la sangre de embriones en escena de pescado para el análisis de urea y creatinina contenido, ya que son demasiado pequeñas. Además, el pez cebra no producen suficiente orina para la prueba en un simple proteinuria 'varilla', que a menudo se lleva a cabo durante los exámenes iniciales de los pacientes. Se describe un ensayo fluorescente que utiliza la transparencia óptica del pez cebra para controlar cuantitativamente la liquidación de un colorante fluorescente, con el tiempo, a partir de la vasculatura y hacia fuera a través del riñón, para dar una lectura de la función renal 1,6-9.
Introduction
El riñón humano juega un papel crucial en el filtrado de los desechos metabólicos de la sangre y la recuperación de solutos necesarios para mantener la homeostasis celular. Hay un número de enfermedades genéticas humanas que causan disfunción renal. La enfermedad renal hereditaria más común es la enfermedad renal poliquística autosómica dominante (PQRAD) caracterizada por el desarrollo de los sacos llenos de líquido dentro de túbulos nefríticos; el daño causado por la quistogénesis es perjudicial para la función renal 10. PQRAD tiene una ocurrencia de 1: 800 – 1: 1000 y representa el 8 – 10% de los pacientes en insuficiencia renal terminal (IRT) 11. Varios genes han sido implicados para causar PQRAD incluyendo policistina-1 (PKD1) y -2 (PKD2), que representa aproximadamente el 85% y el 15% de los casos, respectivamente 12,13. Además, los productos génicos para PKD1 y -2 se localizan en el cilio y son fundamentales para ciliogenesis 14,15. Existe ahora una familia reconocida de trastornos genéticos humanos, conocidos comolos ciliopatías, que afectan a la función de los cilios y dan lugar a ERC 16.
El creciente número de enfermedades genéticas humanas que afectan el desarrollo y la función ciliar está atrayendo el interés mundial en este orgánulo vestigial una vez considerado. El cilio, un saliente celular-cabello como, está enriquecida con los receptores y canales iónicos necesarios para la transducción de eventos de señalización celular clave. El cilio consiste en un axonema a base de microtúbulos, típicamente estructurado en nueve dobletes de microtúbulos dispuestos radialmente con o sin un par central de microtúbulos singlete. La estructura axonemal define el tipo y modo de acción ciliar. La disposición de los microtúbulos 9 + 2 confiere a la motilidad del cilio donde se utiliza en el movimiento de los fluidos a través de las superficies epiteliales. La configuración 9 + 0 es no móviles, pero se cree que es principalmente función en eventos de señalización celular 17. Aparte de ERC, las consecuencias de la disfunción ciliar son un conjunto de característicascaracterísticas ciliopatía que incluyen, la obesidad, la degeneración de la retina, polidactilia, y el deterioro cognitivo 16. Sin embargo, la ERC es una de las más perjudiciales para la calidad de vida del paciente y, por tanto, una importante fuerza impulsora detrás del desarrollo de su caso en modelos in vivo para ciliar relacionada con la ERC.
El pez cebra es un excelente modelo para comprender la etiología de la enfermedad genética humana. Su desarrollo rápido, la producción de un gran número de huevos, tejido transparente, y el crecimiento ex utero permite procesos de desarrollo de pez cebra a ser visualizados y eventos biológicos manipulados con facilidad considerable. Los genes pueden ser alterados genéticamente utilizando el reciente éxito de herramientas de edición genoma (CRISPR 18 y TALENS 19), derribados usando tecnología antisentido de morfolino 20, o farmacológicamente regulados por la adición de compuestos a su medio ambiente acuático. De hecho, el pez cebra ofrece una plataforma para llevar a cabo experimentos que no son permisivos en otros modelos animales. Mientras que el pez cebra son vertebrados relativamente simples (en comparación con los seres humanos) que comparten muchos órganos funcionalmente conservados, los genes y los procesos de señalización en común con los seres humanos. Por ejemplo, el riñón pez cebra es notablemente similar en estructura y función en comparación con los seres humanos 21,22. Sin embargo, a diferencia del riñón de mamífero que se desarrolla a través de una sucesión de fases, cada una marcada por un riñón más desarrollada (pronefros, mesonefros y metanefros), el pez cebra embrionarias sólo se desarrolla una pronefros, la forma más inmadura de un riñón. Mientras millones de nefronas se encuentran formando los bloques de construcción del riñón de los mamíferos, el embrión de pez cebra sólo poseen dos. Los glomérulos, que permiten el filtrado de sangre inicial, se fusionan en la línea media ventral sólo a la aorta. Filtros de sangre a través de los glomérulos en los túbulos pronéfricos que se ejecutan en sentido caudal a lo largo del eje, la fusión antes de salir a través de la cloaca. El pronephric tubules están fuertemente ciliadas con cilios móviles que son permisivas para el flujo de filtrado hacia la salida caudal 3,4. Esta estructura pronephric sencillo mantiene la homeostasis pez cebra a través de varias semanas de crecimiento de las larvas en el que el tiempo se convierten en una estructura más compleja mesonefros 21. Sin embargo, el pez cebra nunca desarrolla un metanefros 21. A pesar de las idiosincrasias de pez cebra, la nefrona pez cebra se segmenta con perfiles de expresión génica igual a la observada en los mamíferos y por lo tanto ofrece una incomparable modelo in vivo para la nefrogénesis 3,22.
Rutinariamente a los pacientes se prueban para la función renal a través de una serie de pruebas de sangre y orina. Típicamente, la sangre se analiza para disuelto sales, urea y creatinina. Los altos niveles de urea, creatinina y concentraciones anormales de sal son indicativos de problemas con la función renal. Análisis de orina utilizando una tira reactiva colorimétrica detecta niveles anormales de proteína, blood, pus, bacterias y azúcar presente en muestras de orina. Estas pruebas normalmente requieren aproximadamente 30 ml de orina o de 5-10 ml de sangre. Ha sido difícil traducir estos tipos de ensayos a pequeña en organismos modelo in vivo, tales como el pez cebra, debido principalmente a la naturaleza imposible de recogida de sangre u orina suficiente para realizar el ensayo. Aquí, nos dirigimos a la falta de pruebas de función renal pez cebra apropiadas y describimos una técnica innovadora para su estudio. Mediante la inyección de un tinte fluorescente en la corriente sanguínea que son capaces de controlar y cuantificar de forma individual en el tiempo de la filtración y la excreción de la actividad fluorescente de la sangre a través del riñón. Este método puede ser utilizado para estudiar el daño renal causada por la enfermedad, que proporcionan un ejemplo de.
Protocol
Representative Results
Discussion
El pez cebra ofrece una valiosa herramienta para modelar la enfermedad genética humana, su utilización como instrumento científico para la investigación in vivo han permitido estudios detallados de la descomposición genética de muchos sistemas biológicos, incluido el riñón. Mucho ahora se entiende acerca de cómo se desarrolla y funciona el riñón pez cebra. Las similitudes con nefrogénesis humana y la homología con los genes causantes de enfermedades 21 ha ilustrado cómo el pez…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La asistencia técnica proporcionada por Jaipreet Bharj. Este trabajo fue apoyado por becas de la UE-FP7 (SYSCILIA -241.955) y El Riñón Fundación holandesa (CP11.18).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
