蛍光クリアランスアッセイを用いてゼブラフィッシュ腎臓機能の評価
Summary
ゼブラフィッシュは、慢性腎臓病（CKD）をモデル化するための一般的なツールである。しかし、それらの小さいサイズは、それが不可能な従来の方法を使用して腎機能を評価することを可能にする。私たちは、CKDにおけるゼブラフィッシュ腎臓機能の定量的な分析を可能にする蛍光色素腎クリアランスアッセイ1を記述する。
Abstract
ゼブラフィッシュ胚は、器官形成を研究し、人間の遺伝病をモデル化するための扱いやすいモデルを提供しています。その相対的なシンプルさにもかかわらず、ゼブラフィッシュ腎臓が開発し、人間とほぼ同じように機能します。ヒト腎臓の建設に大きな違いは、唯一の2があるゼブラフィッシュに比べネフロンの数百万の存在である。しかし、基本的な機能単位にそのような複雑なシステムを簡素化することは、腎臓が開発し、どのように動作するかの理解を助けている。ゼブラフィッシュでは、正中線に位置する糸球体は、排出腔で互いに融合する前に、胚軸上下左右対称に実行するように分岐する2前腎細管への最初の血液濾過を担当しています。前腎 細管は重く最終的に排出腔2-4を経由して、終了する前に、各種の溶質の交換を可能にする、セグメント化された尿細管に沿って、ろ液の移動を容易に運動性の繊毛が移入されている。 CKD株式会社の責任多くの遺伝子繊毛形成に関連するものをluding、ゼブラフィッシュ5に研究されている。しかし、主要なドローバック、遺伝子操作した後にゼブラフィッシュ腎機能を評価するのが困難となっている。ヒトで腎機能障害を測定するための伝統的なアッセイは、主に彼らの水生環境と小型サイズのため、ゼブラフィッシュに非翻訳を証明している。例えば、胚から血液を抽出するために、物理的に不可能であり、それらが小さすぎるように、尿素およびクレアチニン含有量の分析のために魚を上演した。また、ゼブラフィッシュは、多くの場合、最初の患者の検査中に実施されるシンプルな蛋白尿「ディップスティック」、上のテストのための十分な尿を生成しない。我々は、腎機能1,6-9からの読み出しを与えるように、血管系から出腎臓を介して、経時的に、定量的蛍光色素のクリアランスを監視するためにゼブラフィッシュの光透過性を利用した蛍光アッセイを記載する。
Introduction
ヒト腎臓は、血液からの代謝老廃物を濾過し、細胞の恒常性を維持するために必要な溶質を回収することに重要な役割を果たしている。腎機能障害の原因となるヒトの遺伝疾患がいくつかあります。最も一般的な遺伝性腎疾患は腎炎尿細管内の流体満たされた嚢の開発によって特徴付けられる常染色体優性多発性嚢胞腎（ADPKD）です。嚢胞形成に起因する損傷は、腎臓機能10にとって有害である。 1,000 8占める-末期腎不全（ESRF）11の患者の10％：800から1：ADPKD 1の発生がある。いくつかの遺伝子は約85％と、それぞれ12,13症例の15％を占め、ポリシスチン1（PKD1）および-2（PKD2）を含む、ADPKDを引き起こすことが関係している。さらに、遺伝子PKD1のための製品と-2は、繊毛に局在し、繊毛形成14,15の基本である。として知られているヒトの遺伝性疾患の認識の家族は、用意されました繊毛の機能に影響を与え、CKD 16もたらすciliopathies。
毛様体の発達と機能に影響を与える人間の遺伝性疾患の増加数は、このかつて考えられて残留細胞小器官におけるグローバル関心を集めている。繊毛、毛様細胞性突起は、重要な細胞シグナル伝達事象の伝達に必要な受容体及びイオンチャンネルに濃縮される。繊毛は、一般的に、または一重微小管の中央ペアなしで9放射状に配置された微小管のダブレットに構造化微小管ベースの軸糸で構成されています。軸糸構造は、繊毛作用の種類とモードを定義します。 9 + 2微小管の配置は、それが上皮表面を横切る流体の移動に利用されている繊毛に運動を付与する。 9 + 0構成は、非運動性であるが、主に細胞のシグナル伝達事象17において機能すると考えられている。別にCKDから、毛様体機能障害の影響は、特徴のセットです、肥満、網膜変性、多指症、及び認知障害16を含むciliopathy機能。しかし、CKDは、患者の生活の質に最も有害なので、毛様体関連CKDのためのin vivoモデルで適切なの発展の主要な推進力の中で。
ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病の病因を理解するための優れたモデルです。彼らの迅速な開発は、卵の大多数、透明な組織、および子宮外の成長の生産は、ゼブラフィッシュの発生過程を可視化し、生物学的事象が、かなり簡単に操作することができるようになります。遺伝子は、遺伝的に、ゲノム編集ツール（CRISPR 18とTALENS 19）の最近の成功を使用して変更するアンチセンスモルホリノ技術20を用いてノックダウン、または薬理学的に彼らの水生環境に対する化合物の添加によって調節することができる。確かに、ゼブラフィッシュは、電子を実施するためのプラットフォームを提供します他の動物モデルにおいて許容されないxperiments。ゼブラフィッシュ一方で、彼らは人間と共通する多くの機能的に保存された臓器、遺伝子、およびシグナル伝達プロセスを共有する（ヒトに比べて）比較的単純な脊椎動物である。例えば、ゼブラフィッシュの腎臓は、人間21,22に比べて構造及び機能で非常に似ています。しかし、位相の連続を通じて開発した哺乳動物の腎臓とは異なり、それぞれがより発展腎臓（前腎、中腎、および後腎）でマークされ、胚のゼブラフィッシュは、前腎、腎臓の最も未熟型を開発しています。ネフロン数百万の哺乳類の腎臓のビルディングブロックを形成見つけることができる一方で、ゼブラフィッシュ胚2つだけを持っている。初期の血液濾過液を可能に糸球体は、大動脈のちょうど腹側正中で融合されている。排出腔を経由して終了する前に融合させ、軸に沿って尾側に実行する前腎細管への糸球体を通して血液フィルター。前腎TUbulesは重く尾側の出口3,4に向けたろ液の流れに許容され、運動性繊毛と繊毛されている。この単純な前腎構造は、彼らが最終的にはより複雑な中腎構造21へと発展幼虫の成長の数週間を通じてゼブラフィッシュの恒常性を維持します。しかし、ゼブラフィッシュは、後腎21を開発したことがない。ゼブラフィッシュ特異性にもかかわらず、ゼブラフィッシュネフロンは、哺乳類で観察されたものと同等の遺伝子発現プロファイルでセグメント化され、したがって腎形成3,22のための生体モデルで他の追随を許さないを提供しています。
日常的に患者の血液および尿検査の一連の腎機能について試験される。典型的には、血液を溶解した塩、尿素およびクレアチニンについて分析する。尿素、クレアチニンおよび異常な塩濃度の高いレベルは、腎機能の問題を示している。比色ディップスティックを使用して尿検査は、タンパク質、する当館の異常なレベルを検出し、dは、膿、細菌および尿サンプル中に存在する糖。 10ミリリットルの血液 – このようなテストは、通常、約30ミリリットルの尿または5が必要です。これは、主として、アッセイを行うために十分な血液や尿を収集不可能な性質のために、そのようなゼブラフィッシュのような生体内モデル生物、 小にこれらのタイプのアッセイを翻訳することは困難であった。ここでは、適切なゼブラフィッシュ腎機能検査の不足に対処し、その研究のための革新的な技術が記載されている。血流中に蛍光色素を注入することにより、我々は、腎臓を介して血液からろ過し、蛍光活性の排泄を監視し、個別に時間をかけて定量化することができる。この方法では、我々は、例を提供する病気によって引き起こされる腎障害を研究するために使用することができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
ゼブラフィッシュは、人間の遺伝病をモデル化するための貴重なツールを提供し、in vivoでの研究のための科学的な楽器としてのそれらの使用は、腎臓を含む多くの生物学的システムの遺伝内訳の詳細な研究を可能にしてきた。多くは今ゼブラフィッシュ腎臓の発達や機能方法について理解されている。病気の原因遺伝子と人間の腎形成と相同性に印象的な類似点21は、ゼブラ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Jaipreet Bharjからの技術サポート。この作業は、EU-FP7（SYSCILIA -241955）とオランダの腎臓財団（CP11.18）からの補助金によってサポートされていました。
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
