Оценка данио рерио функции почек с помощью флуоресцентного Зазор Пробирной
Summary
Данио является популярным инструментом для моделирования хронической болезни почек (ХБП). Тем не менее, их небольшой размер делает невозможным оценить функцию почек с использованием традиционных методов. Мы описываем почек флуоресцентный краситель оформление анализ 1, что позволяет количественный анализ рыбок данио функции почек в ЦП.
Abstract
Данио рерио эмбрион предлагает послушный модель для изучения органогенеза и модель человеческих генетических заболеваний. Несмотря на свою относительную простоту, данио почки развивается и функционирует почти так же, как и людей. Основное различие в конструкции почки человека является наличие миллионов нефронов по сравнению с данио, который имеет только два. Однако, упрощая такую сложную систему в основных функциональных узлов способствовал нашему пониманию того, как развивается почечная и работает. У рыбок данио, срединный находится клубочек отвечает за начальный фильтрации крови в двух pronephric канальцев, что расходятся, чтобы запустить в двустороннем вниз эмбриональной оси до слияния друг с другом в клоаку. В pronephric трубочки обильно населены подвижных ресничек, которые облегчают движение фильтрата по сегментной трубочку, позволяющая обмениваться различными растворенных веществ, прежде чем, наконец, выход через клоаку 2-4. Многие гены, ответственные за ХБП, IncЛУДИНГ, связанные с ресничек, были изучены у рыбок данио 5. Тем не менее, основным отступать было трудность в оценке данио функции почек после генетической манипуляции. Традиционные тесты для измерения дисфункции почек у людей оказались без поступательной к рыбок данио, главным образом из-за их водной среды и небольшого размера. Например, это физически невозможно извлечь кровь из эмбриональных поставлена рыбы для анализа мочевины и креатинина содержанием, так как они слишком малы. Кроме того, данио не производят достаточно мочи на анализ на простых протеинурии "щупе», который часто осуществляется в ходе первоначальных пациента экзаменов. Опишем флуоресцентного анализа, который использует оптическую прозрачность данио, чтобы количественно контролировать зазор флуоресцентным красителем, с течением времени, из сосудистой и наружу через почки, чтобы дать считывать из функции почек 1,6-9.
Introduction
Почки человека играет решающую роль в фильтрации обмена веществ из крови и выделение необходимых растворенные вещества для поддержания клеточного гомеостаза. Есть ряд генетических заболеваний человека, которые вызывают дисфункцию почек. Наиболее распространенным наследственным почечная болезнь аутосомно-доминантное заболевание поликистоз почек (ADPKD) характеризуется развитием наполненных жидкостью мешочки в пределах почечных канальцев; Ущерб, причиненный cystogenesis вредно для функции почек 10. ADPKD имеет возникновение 1: 800 – 1: 1000 и составляет 8 – 10% больных в терминальной стадии почечной недостаточности (ESRF) 11. Несколько генов были вовлечены, чтобы вызвать ADPKD включая Polycystin-1 (PKD1) и -2 (PKD2), что составляет примерно 85% и 15% случаев, соответственно 12,13. Кроме того, генные продукты для PKD1 и -2 локализуются в реснички и имеют основополагающее значение для ресничек 14,15. Существует в настоящее время признается семья генетических нарушений у человека, известных какв цилиопатий, которые влияют на реснички функцию и приводят к CKD 16.
Все большее число генетических заболеваний человека, влияющих на развитие ресничек и функцию привлекает всеобщий интерес к этой когда-то считался рудиментарным органеллы. Ресничка, похожие на волосы сотовой выступ, обогащается с рецепторами и ионными каналами, необходимых для трансдукции ключевых событий клеточных сигналов. Реснички состоит из микротрубочек на основе аксонемы, как правило, структурированного на девять радиально расположенных микротрубочек дублетов с или без центрального пары синглетных микротрубочек. Структура axonemal определяет тип и режим работы цилиарной действий. Устройство микротрубочек 9 + 2 дает подвижность в реснички, где он используется в движении жидкости через эпителиальные поверхности. Конфигурация 9 + 0 не является подвижны, но, как полагают, в основном функции в мероприятиях, клеточной сигнализации 17. Помимо ХБП, последствия мерцательной дисфункции набор характеристикаЦилиопатии функции, которые включают в себя, ожирение, дегенерации сетчатки, полидактилия и когнитивные нарушения 16. Однако, CKD является одним из самых вредно для качества в жизни пациента и, следовательно, основной движущей силой развития соответствующих в моделях естественных условиях для цилиарной связанных ХБП.
Данио является отличной моделью для понимания этиологии человеческих генетических заболеваний. Их быстрое развитие, производство большого количества яиц, прозрачной ткани, и экс роста внутриутробного позволяет данио процессы развития для визуализации и биологические явления манипулировать со значительным легкостью. Гены могут быть генетически изменено с помощью недавние успехи инструментов для редактирования генома (CRISPR 18 и Talens 19), сбит с использованием антисмысловой технологии морфолино 20, или его фармакологически регулируется путем добавления соединений в их водной среды. Действительно, данио предложить платформу для проведения электроннойxperiments, которые не разрешающим в других моделях на животных. Несмотря на то, данио относительно простые позвоночные (по сравнению с людьми), они имеют много функционально консервативные органы, гены и сигнальных процессов общего с людьми. Например, данио почки удивительно похожи по структуре и функции по сравнению с людьми 21,22. Однако, в отличие от почек млекопитающих, который развивается через последовательность фаз, каждая отмечена более развитой почки (предпочки, мезонефрос и metanephros), эмбриональные данио только развивает предпочки, наиболее незрелые формы почки. Несмотря на то, миллионы нефронов можно найти образуя строительные блоки почки млекопитающих, данио эмбрион обладают только два. Клубочки, которые позволяют для первоначального фильтрата крови, сливают на средней линии вентральной только в аорте. Фильтры крови через клубочки в pronephric канальцев, которые работают в каудальном вдоль оси, фьюзинг до выхода через клоаку. Pronephric Туbules сильно реснитчатые с подвижных ресничек, которые разрешающим к потоку фильтрата в направлении хвостовой выходе 3,4. Этот простой pronephric структура сохраняет данио гомеостаза через несколько недель роста личинок, где они в конечном итоге превратиться в более сложной мезонефрос структуры 21. Тем не менее, данио никогда не развивается metanephros 21. Несмотря на рыбок данио идиосинкразии, данио нефрона сегментирован с профилями экспрессии генов равные тому, что наблюдается у млекопитающих и, таким образом, предлагает не имеющие аналогов в естественных условиях модели для нефрогенеза 3,22.
Регулярно пациенты испытывали на функцию почек через серию крови и в моче испытаний. Обычно кровь анализировали на растворенных солей, мочевины и креатинина. Высокие уровни мочевины, креатинина и аномальных концентраций соли указывают на проблемы с функцией почек. Анализ мочи с помощью колориметрического щуп обнаруживает аномальные уровни белка, Blood, гной, бактерии и сахар присутствует в образцах мочи. Такие тесты обычно требуют приблизительно 30 мл мочи или 5 – 10 мл крови. Это было трудно перевести эти типы анализов с малым в естественных условиях модельных организмов, таких, как данио, главным образом, из-за невозможности характера сбора достаточного количества крови или мочи для выполнения анализа. Здесь мы обращаемся за отсутствия соответствующих данио испытаний функции почек и описать инновационную технологию для ее изучения. Вводя флуоресцентного красителя в кровоток, мы можем контролировать и индивидуально количественно с течением времени фильтрации и экскреции флуоресцентного деятельности из крови через почки. Этот метод может быть использован для изучения повреждение почек, вызванное болезнью, которую мы приведем пример того,.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио рерио предложить ценный инструмент для моделирования человеческих генетических заболеваний, их использование в качестве научного инструмента для в естественных условиях исследования позволили детально изучить генетический пробоя многих биологических систем, в том числ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Техническая помощь, оказываемая Jaipreet Bharj. Эта работа была поддержана грантами от ЕС FP7 (SYSCILIA -241955) и голландской почки Foundation (CP11.18).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller | Intracel | P-97 | |
| borosilicate standard wall capillaries | Harvard Apparatus | 30-0017 | |
| Glass microscope slides | VWR International | 631-0109 | |
| Epoxy Resin Glue | Evo-Stik | ||
| Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran | Life technologies | D-1824 | |
| N-Phenylthiourea | Sigma-Aldrich | P7629 | |
| Methylene blue | Sigma-Aldrich | M9140 | |
| Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt | Sigma-Aldrich | A5040 | |
| methylcellulose | Sigma-Aldrich | M0512 | |
| air compressor | Jun-Air | OF302-15 | |
| Picospritzer III | Parker Instruments | 051-0500-900 | |
| compact 3-axis control micromanipulator | Marzhauser | MM33 | |
| Dissecting stereo microscope | Nikon | SMZ1000 | |
| microloader tips | Eppendorf | 5242956003 | |
| Dumont #5 forceps | Sigma-Aldrich | F6521 | |
| stage micrometer | Pyser- SGI | 02A00404 |
References
- Hentschel, D. M., et al. Acute renal failure in zebrafish: a novel system to study a complex disease. Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), 923-929 (2005).
- Drummond, I. Making a zebrafish kidney: a tale of two tubes. Trends Cell Biol. 13 (7), 357-365 (2003).
- Ma, M., Jiang, Y. J. Jagged2a-notch signaling mediates cell fate choice in the zebrafish pronephric duct. PLoS Genet. 3 (1), e18 (2007).
- Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros. Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).
- Drummond, I. A. Kidney development and disease in the zebrafish. J Am Soc Nephrol. 16 (2), 299-304 (2005).
- Cardenas-Rodriguez, M., et al. Characterization of CCDC28B reveals its role in ciliogenesis and provides insight to understand its modifier effect on Bardet-Biedl syndrome. Hum Genet. 132 (1), 91-105 (2013).
- Osborn, D. P., et al. Loss of FTO antagonises Wnt signaling and leads to developmental defects associated with ciliopathies. PLoS One. 9 (2), e87662 (2014).
- Pearson, C. G., Osborn, D. P., Giddings, T. H., Beales, P. L., Winey, M. Basal body stability and ciliogenesis requires the conserved component Poc1. J Cell Biol. 187 (6), 905-920 (2009).
- Tobin, J. L., Beales, P. L. Restoration of renal function in zebrafish models of ciliopathies. Pediatr Nephrol. 23 (11), 2095-2099 (2008).
- Torres, V. E., Harris, P. C. Autosomal dominant polycystic kidney disease: the last 3 years. Kidney Int. 76 (2), 149-168 (2009).
- Bogdanova, N., Markoff, A., Horst, J. Autosomal dominant polycystic kidney disease – clinical and genetic aspects. Kidney Blood Press Res. 25 (5), 265-283 (2002).
- Harris, P. C., Ward, C. J., Peral, B., Hughes, J. Polycystic kidney disease. 1: Identification and analysis of the primary defect. J Am Soc Nephrol. 6 (4), 1125-1133 (1995).
- Reynolds, D. M., et al. Aberrant splicing in the PKD2 gene as a cause of polycystic kidney disease. J Am Soc Nephrol. 10 (11), 2342-2351 (1999).
- Pazour, G. J., San Agustin, a. j. t., Follit, J. A., Rosenbaum, J. L., Witman, G. B. Polycystin-2 localizes to kidney cilia and the ciliary level is elevated in orpk mice with polycystic kidney disease. Curr Biol. 12 (11), R378-R380 (2002).
- Yoder, B. K., Hou, X., Guay-Woodford, L. M. The polycystic kidney disease proteins, polycystin-1, polycystin-2, polaris, and cystin, are co-localized in renal cilia. J Am Soc Nephrol. 13 (10), 2508-2516 (2002).
- Baker, K., Beales, P. L. Making sense of cilia in disease: the human ciliopathies. Am J Med Genet C Semin Med Genet. 151C (4), 281-295 (2009).
- Veland, I. R., Awan, A., Pedersen, L. B., Yoder, B. K., Christensen, S. T. Primary cilia and signaling pathways in mammalian development, health and disease. Nephron Physiol. 111 (3), 39-53 (2009).
- Hruscha, A., et al. Efficient CRISPR/Cas9 genome editing with low off-target effects in zebrafish. Development. 140 (24), 4982-4987 (2013).
- Bedell, V. M., et al. In vivo genome editing using a high-efficiency TALEN system. Nature. 491 (7422), 114-118 (2012).
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don’t stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Gerlach, G. F., Wingert, R. A. Kidney organogenesis in the zebrafish: insights into vertebrate nephrogenesis and regeneration. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 559-585 (2013).
- Wingert, R. A., et al. The cdx genes and retinoic acid control the positioning and segmentation of the zebrafish pronephros. PLoS Genet. 3 (10), 1922-1938 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book. A guide for the laboratory use of zebrafish (Danio Rerio). , (2000).
- Forsythe, E., Beales, P. L. Bardet-Biedl syndrome). Eur J Hum Genet. 21 (1), 8-13 (2013).
- Corbetta, S., et al. High prevalence of simple kidney cysts in patients with primary hyperparathyroidism. J Endocrinol Invest. 32 (8), 690-694 (2009).
- Veleri, S., et al. Knockdown of Bardet-Biedl syndrome gene BBS9/PTHB1 leads to cilia defects. PLoS One. 7 (3), e34389 (2012).
- Vize, P., Woolf, A. S., Bard, J. . The Kidney: From Normal Development to Congenital Disease. , (2003).
- Chang, R. L., et al. Permselectivity of the glomerular capillary wall to macromolecules. II. Experimental studies in rats using neutral dextran. Biophys J. 15 (9), 887-906 (1975).
