Utvärdering av Zebrafish njurfunktion med hjälp av en fluorescerande Clearance Assay

Summary

Den zebrafisk är ett populärt verktyg för att modellera kronisk njursjukdom (CKD). Emellertid gör deras ringa storlek det omöjligt att utvärdera njurfunktion med traditionella metoder. Vi beskriver en fluorescerande färg njure clearance analys ¹ som tillåter kvantitativ analys av zebrafisk njurfunktionen hos CKD.

Abstract

Den zebrafisk embryo erbjuder en lätthanterlig modell för att studera organogenesen och modellera människans genetiska sjukdomar. Trots sin relativa enkelhet, utvecklar den zebrafisk njure och funktioner i nästan samma sätt som människor. En stor skillnad i konstruktionen av den humana njuren är närvaron av miljontals nefroner jämfört med zebrafisk som har endast två. Men förenkla sådant komplext system i grundläggande funktionella enheter har hjälpt vår förståelse av hur njuren utvecklar och driver. I zebrafisk, är mittlinjen belägen glomerulus svarar för den första blodfiltrering i två pronephric tubuli som divergerar för att köra bilateralt ned den embryonala axeln innan den fixeras till varandra vid kloaken. De pronephric tubuli är kraftigt befolkas av rörliga cilier som underlättar förflyttning av filtratet längs segmente tubuli, vilket gör utbyte av olika lösta ämnen innan de slutligen lämnar via kloaken ^2-4. Många gener som ansvarar för CKD, including de som rör ciliogenesis, har studerats i zebrafisk ^5. Men en viktig dra tillbaka har varit svårigheten att utvärdera zebrafisk njurfunktion efter genetisk manipulation. Traditionella analyser för att mäta njurdysfunktion hos människor har visat icke translationell till zebrafisk, främst på grund av deras vattenmiljön och liten storlek. Till exempel är det inte fysiskt möjligt att extrahera blod från embryonala iscensatt fisk för analys av urea och kreatinin innehåll, eftersom de är för små. Dessutom har zebrafisk inte producerar tillräckligt urin för att testa på en enkel proteinuri "mätsticka", som ofta utförs under första patienten undersökningar. Vi beskriver en fluorescerande analys som utnyttjar optiska insyn i zebrafisk att kvantitativt övervaka clearance av en fluorescerande färg, över tiden, från kärl och ut genom njurarna, för att ge en läsning av njurfunktionen ^1,6-9.

Introduction

Den mänskliga njure spelar en avgörande roll för att filtrera metaboliska avfall från blodet och återvinna krävs lösta ämnen för att upprätthålla cellulär homeostas. Det finns ett antal av humana genetiska sjukdomar som orsakar njurdysfunktion. Den vanligaste ärvde njursjukdom är autosomalt dominant polycystisk njursjukdom (ADPKD) kännetecknas av utveckling av vätskefyllda blåsor inom nefritiska tubuli; skador som orsakats av cystogenesis är skadligt för njurfunktionen ^10. ADPKD har en förekomst av 1: 800 till 1: 1000 och motsvarar 8 – 10% av patienterna i terminal njursvikt (ESRF) ^11. Flera gener har varit inblandade för att orsaka ADPKD inklusive polycystin-1 (PKD1) och -2 (PKD2), som står för cirka 85% och 15% av fallen respektive ^12,13. Dessutom genprodukter för PKD1 och -2 lokalisera till cilium och är grundläggande för ciliogenesis ^14,15. Det finns nu en erkänd familj av genetiska sjukdomar, så kalladede ciliopathies som påverkar flimmerhår funktion och resultera i CKD ^16.

Det ökande antalet genetiska sjukdomar som påverkar ciliär utveckling och funktion drar globala intresset för detta en gång betraktades vestigial organell. Den cilium, ett hår-liknande cellulär utstick, är berikad med receptorer och jonkanaler som är nödvändiga för transduktion av viktiga cellsignaleringshändelser. Den cilium består av en mikrotubuli baserad axoneme, vanligen uppdelad i nio radiellt arrangerade mikrotubuli dubletter med eller utan ett centralt par sing mikrotubuli. Den axonemal strukturen definierar typen och läget av ciliär åtgärder. Den 9 + 2 mikrotubuli arrangemang ger motilitet till cilium där den används i rörelsen av vätskor över epitelytor. Den 9 + 0-konfiguration är icke rörliga men tros främst fungerar i cellulära signaleringshändelser ^17. Förutom CKD, konsekvenserna av ciliär dysfunktion är en uppsättning av karakteristiskaciliopathy funktioner som inkluderar, fetma, retinal degeneration, polydactyly och kognitiv svikt ^16. Dock är CKD bland de mest skadliga för patientens livskvalitet och därför en viktig drivkraft bakom utvecklingen av lämpliga in vivo-modeller för ciliary relaterad CKD.

Den zebrafisk är en utmärkt modell för att förstå etiologin av mänsklig genetisk sjukdom. Deras snabba utveckling, produktion av stort antal ägg, transparent vävnad, och ex utero tillväxt gör zebrafisk utvecklingsprocesser som ska visualiseras och biologiska händelser manipuleras med stor lätthet. Gener kan genetiskt ändras med den senaste tidens framgångar genomet redigeringsverktyg (CRISPR ¹⁸ och Talens ^19), slog ner med hjälp av antisens morfolino teknik ^20, eller farmakologiskt regleras genom tillsats av föreningar till deras vattenmiljö. Faktum zebrafisk erbjuda en plattform för att bedriva experiments som inte tillåt i andra djurmodeller. Medan zebrafisk är relativt enkla ryggradsdjur (jämfört med människor) de delar många funktionellt bevarade organ, gener och signalprocesser gemensamt med människor. Till exempel är den zebrafisk njuren påfallande lika i struktur och funktion jämfört med människor ^21,22. Men till skillnad från däggdjur njuren som utvecklar genom en rad faser, var och präglas av en mer utvecklad njure (pronephros, mesonephros och metanefros), bara den embryonala zebrafisk utvecklar en pronephros, den mest omogna formen av en njure. Medan miljontals nephrons kan hittas bildar byggstenar däggdjurs njure, bara zebrafisk embryot besitter två. Glomeruli, vilket gör det möjligt för den initiala blod filtratet, smälts vid mittlinjen bara ventrala till aorta. Blod filter genom glomeruli i de pronephric tubuli som kör kaudalt längs axeln, fusing före avsluta via kloaken. Den pronephric tubules är kraftigt cilie med rörliga cilier som är tillåtande för flödet av filtrat mot svans exit ^3,4. Denna enkla pronephric struktur bibehåller zebrafisk homeostas genom flera veckors larv tillväxt där de så småningom utvecklas till en mer komplex mesonephros strukturen ^21. Dock utvecklar zebrafisk aldrig ett metanefros ^21. Trots de zebrafisk egenheter, är zebrafisk nefronet segmenterad med genuttrycksprofilerna lika med den som observerats hos däggdjur och erbjuder därmed en oöverträffad in vivo modell för nephrogenesis ^3,22.

Rutinmässigt patienter testas för njurfunktionen genom en serie av blod och urintester. Typiskt blodet analyseras för lösta salter, urea och kreatinin. Höga nivåer av urea, kreatinin och onormala saltkoncentrationer indikerar problem med njurfunktionen. Urinanalys med hjälp av en kolorimetrisk mätsticka upptäcker onormala nivåer av protein, blood, pus, bakterier och socker som finns i urinprover. Sådana tester kräver normalt cirka 30 ml urin eller 5 – 10 ml blod. Det har varit svårt att omsätta dessa typer av analyser för att små in vivo modellorganismer, såsom zebrafisk, främst på grund av det omöjliga natur samla tillräckligt med blod eller urin för att utföra analysen. Här, vi åtgärda bristen på lämpliga zebrafisk njure funktionstester och beskriva en innovativ teknik för sin studie. Genom att injicera ett fluorescerande färgämne i blodet kan vi övervaka och individuellt kvantifiera över tiden filtreringen och utsöndring av fluorescerande aktivitet från blodet via njurarna. Denna metod kan användas för att studera njurskada orsakad av sjukdom, som vi tillhandahåller ett exempel på.

Protocol

Etik Uttalande: Animal underhåll, djurhållning och förfaranden definieras och kontrolleras av djur (vetenskapliga förfaranden) Act 1986. Alla djurförsök har utförts under licenser som beviljats ​​av inrikesministern (PIL nr 70/7892) i överensstämmelse med biologisk Services Management Group och biologisk Tjänster etiska kommitté, SGUL, London, Storbritannien. Alla ansträngningar gjordes för att minska antalet djur som används och att förfina både rutiner och djurhållning för att minimera lidandet o…

Representative Results

Bardet-Biedl syndrom (BBS) är en sällsynt heterogen ciliopathy som drabbar ungefär 1: 160.000 människor världen 16. Patienter som före med ett antal tillhörande problem inklusive polycystiska njurar, därefter patienter behöver ofta njur dialys eller transplantation 24. ESRF är den vanligaste dödsorsaken i BBS, med cirka 30% av patienterna utvecklar CKD 16. För närvarande har 20 icke-relaterade gener varit inblandad i BBS utan publicerade genotyp-fenotyp association. BBS prot…

Discussion

Zebrafisk erbjuda ett värdefullt verktyg för att modellera människans genetiska sjukdomar, har deras användning som ett vetenskapligt instrument för in vivo forskning möjlig detaljerade studier av den genetiska nedbrytning av många biologiska system, inklusive njuren. Mycket är nu förstås om hur zebrafisk njuren utvecklar och funktioner. De slående likheter med människans nephrogenesis och homologi med sjukdoms orsakar gener ²¹ har illustrerat hur zebrafisk har blivit grundläggande för …

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
P-97 SUTTER Flaming/Brown type micropipette puller	Intracel	P-97
borosilicate standard wall capillaries	Harvard Apparatus	30-0017
Glass microscope slides	VWR International	631-0109
Epoxy Resin Glue	Evo-Stik
Rhodamine B 10,000 MW labeled Dextran	Life technologies	D-1824
N-Phenylthiourea	Sigma-Aldrich	P7629
Methylene blue	Sigma-Aldrich	M9140
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt	Sigma-Aldrich	A5040
methylcellulose	Sigma-Aldrich	M0512
air compressor	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
compact 3-axis control micromanipulator	Marzhauser	MM33
Dissecting stereo microscope	Nikon	SMZ1000
microloader tips	Eppendorf	5242956003
Dumont #5 forceps	Sigma-Aldrich	F6521
stage micrometer	Pyser- SGI	02A00404