Lymphocytes Isolation de la peau humaine pour Analyse phénotypique et<em> Ex Vivo</em> Culture cellulaire
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
La peau humaine a une fonction de barrière importante et contient diverses cellules du système immunitaire qui contribuent à l'homéostasie tissulaire et la protection contre les agents pathogènes. Comme la peau est relativement facile d'accès, il offre une plateforme idéale pour étudier les mécanismes de régulation immunitaire périphériques. cellules résidentes immunitaire en bonne santé conduite de la peau immunosurveillance, mais aussi jouer un rôle important dans le développement des troubles inflammatoires de la peau, comme le psoriasis. En dépit des idées émergentes, notre compréhension de la biologie sous-jacente diverses maladies de peau inflammatoire est encore limitée. Il est nécessaire pour les populations (unique) de cellules isolées de bonne qualité à partir d'échantillons de biopsie de la peau. Jusqu'à présent, les procédures d'isolement ont été gravement entravées par l'absence d'obtention d'un nombre suffisant de cellules viables. L'isolement et l'analyse subséquente ont également été affectés par la perte des marqueurs de la lignée de cellules immunitaires, en raison de la contrainte mécanique et chimique provoquée par les procédés actuels de dissociation pour obtenirsuspension cellulaire unique. Ici, nous décrivons une méthode modifiée pour isoler les cellules de la peau humaine saine et psoriatique impliquée T en combinant la dissociation mécanique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé et le traitement par la collagénase. Cette méthode conserve l'expression de la plupart des marqueurs de la lignée immunes telles que CD4, CD8, et Foxp3 CD11c lors de la préparation des suspensions de cellules isolées. Des exemples d'isolement réussi CD4 + des lymphocytes T et phénotypiques ultérieure et analyse fonctionnelle sont montrées.
Introduction
La peau, comme la principale interface entre le corps et l'environnement, fournit la première ligne de défense contre physique externe, chimiques et biologiques des insultes telles que la blessure, le rayonnement ultraviolet et les micro-organismes. La peau se compose de deux compartiments, l'épiderme et le derme, et contient une variété de cellules immunitaires , y compris les cellules de Langerhans, les macrophages, les cellules dendritiques (DCs), et environ 20 milliards de cellules T mémoire, près de deux fois le nombre présent dans l'ensemble du volume sanguin 1 , 2. Un nombre croissant de données soutient l'idée que la peau a des fonctions immunologiques essentielles, à la fois lors de l'homéostasie tissulaire et dans diverses conditions pathologiques. Les cellules immunitaires résidentes dans la peau normale sont pensés pour mener immunosurveillance 3 et ont été montré à jouer un rôle dans le développement de troubles inflammatoires tels que le psoriasis 4. Dans la peau lésionnelle psoriasique, CD4 + et CD8 + infiltrés cellules T étaient obsdé- laissées , et on a montré que le rapport entre le CD4 et CD8 varie en fonction de l'état de la maladie 5. Cependant, ces populations de cellules sont difficiles à étudier parce que les techniques existantes permettent l'isolement des seules cellules rares.
Les techniques actuellement largement utilisées pour l'isolement de la peau humaine des cellules T combinent mécanique dissociation de la peau avec un traitement enzymatique. Les biopsies de peau humaine sont largement émincées et incubées avec des enzymes comme la trypsine, la collagénase et / ou EDTA 6-8. Considérant que la peau est un tissu de la barrière qui est très résistant aux efforts de traction et de désagrégation mécanique, les méthodes établies d'isolement des cellules T produisent très peu de cellules, et même un nombre plus faible de cellules viables, ce qui rend culture ex vivo de cellules de ces populations cellulaires difficile et difficile.
Nous rapportons ici une méthode modifiée pour isoler les lymphocytes de la peau humaine psoriasique sain et impliqué en combinant mechanla dissociation ique de la peau en utilisant un dissociateur tissulaire automatisé au lieu de la méthode établie de hachage largement, avec une digestion enzymatique à l'aide de la collagénase. Divers sous-ensembles de cellules immunitaires viables, y compris les DC et les lymphocytes T ont été observées après la préparation d'une suspension à cellule unique. Il est important de l'expression des marqueurs de surface CD3, CD4 et CD8 a été bien conservée. Les cellules ainsi préparées sont prêts à être utilisés ex vivo dans des cultures cellulaires ou par cytométrie de flux. Ce protocole a été utilisé avec succès pour l'analyse de biopsies cutanées unique (4 mm) dérivées de la peau lésionnelle des patients atteints de psoriasis. Les résultats ont montré que les cellules T du patient de la peau résidente produites cytokines plus inflammatoires comme l' IL-17 et d' IFNy par rapport aux volontaires sains 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ici, nous présentons un protocole pour isoler efficacement les cellules T résidentes de la peau à partir de biopsies de peau humaine. L'avantage de ce protocole est l'isolement d'un nombre relativement élevé de lymphocytes viables, et l'expression des marqueurs de surface appropriés. Les sous – ensembles de cellules identifiées sont:, les cellules CD11c + PED CD4 + et CD8 + et Foxp3 + CD25 +. Surtout, culture ex vivo des lymphocytes T…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les biopsies cutanées de patients atteints de psoriasis ont été aimablement fournies par le Dr Andreas Koerber (département de dermatologie à l'Université d'Essen, Allemagne) après accord oral ou écrit éclairé à usage scientifique.
XH est également soutenu par NSFC 61263039 et 11101321 NSFC.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
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