El aislamiento de linfocitos de la piel humana para el Análisis y fenotípica<em> Ex Vivo</em> Cultivo Celular
Summary
We describe a protocol to efficiently isolate skin resident T cells from human skin biopsies. This protocol yields sufficient numbers of viable human skin resident lymphocytes for flow cytometric analysis and ex vivo culture.
Abstract
La piel humana tiene una función de barrera importante y contiene diversas células inmunes que contribuyen a la homeostasis del tejido y la protección contra los agentes patógenos. A medida que la piel es relativamente fácil acceso, que proporciona una plataforma ideal para estudiar los mecanismos de regulación inmune periférica. células residentes inmunes en sano conducta piel inmunovigilancia, pero también juegan un papel importante en el desarrollo de trastornos inflamatorios de la piel, tales como psoriasis. A pesar de ideas emergentes, nuestra comprensión de la biología subyacente de diversas enfermedades inflamatorias de la piel es aún limitada. Hay una necesidad de una buena calidad de las poblaciones (individual) de células aisladas a partir de muestras de piel biopsia. Hasta ahora, los procedimientos de aislamiento han sido seriamente obstaculizados por la falta de la obtención de un número suficiente de células viables. El aislamiento y el análisis posterior también se han visto afectados por la pérdida de marcadores de linaje de células inmunes, debido a la tensión mecánica y química causada por los procedimientos de disociación actuales para obtenersuspensión de células individuales. A continuación, describimos un método modificado para aislar las células T de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de disociación mecánica de la piel utilizando un disociador automatizado de tejidos y el tratamiento de colagenasa. Esta metodología conserva la expresión de la mayoría de los marcadores de linaje inmunes tales como CD4, CD8, Foxp3 y CD11c en la preparación de suspensiones de células individuales. Se muestran ejemplos de éxito de aislamiento de células T CD4 + y la posterior fenotípica y análisis funcional.
Introduction
La piel, como la interfaz principal entre el cuerpo y el medio ambiente, proporciona la primera línea de defensa contra la física externa, químicas y biológicas insultos tales como heridas, la radiación ultravioleta y los microorganismos. Piel comprende dos compartimientos principales, la epidermis y la dermis, y contiene una variedad de células inmunes incluyendo las células de Langerhans, macrófagos, células dendríticas (DC), y cerca de 20 millones de células T de memoria, casi dos veces el número presente en todo el volumen de sangre 1 , 2. Una creciente cantidad de datos apoyan la noción de que la piel tiene funciones inmunológicas esenciales, tanto durante la homeostasis del tejido y en diversas condiciones patológicas. Se cree que las células inmunes residentes en la piel normal para llevar a cabo la inmunovigilancia 3 y se ha demostrado que desempeñan un papel en el desarrollo de trastornos inflamatorios tales como psoriasis 4. En la piel lesional psoriásica, tanto CD4 + y CD8 + se infiltraron las células T eran observed y se demostró que la relación de la CD4 y CD8 varía en función del estado de la enfermedad 5. Sin embargo, estas poblaciones de células son difíciles de estudiar porque las técnicas actuales permiten el aislamiento de sólo unas pocas células.
Las técnicas actualmente ampliamente utilizados para el aislamiento de células T de la piel humana se combinan disociación mecánica de la piel con tratamiento enzimático. Las biopsias de piel humana son ampliamente picada y se incubaron con enzimas como la tripsina, colagenasa y / o EDTA 6-8. Teniendo en cuenta que la piel es un tejido de barrera que es altamente resistente a las fuerzas de tracción y desagregación mecánica, los métodos establecidos de aislamiento de células T producen muy pocas células, e incluso un menor número de células viables, lo que hace ex vivo de cultivo de células de estas poblaciones de células difícil y desafiante.
Aquí, se presenta un método modificado para aislar los linfocitos de la piel humana psoriásica saludable y participar mediante la combinación de mechandisociación ical de la piel usando un disociador de tejido automatizado en lugar del método establecido de picado ampliamente, junto con la digestión enzimática usando colagenasa. Se observaron varios subconjuntos de células inmunes viables, incluyendo países en desarrollo y las células T después de la preparación de una suspensión de una sola célula. Es importante destacar que la expresión de los marcadores de superficie CD3, CD4 y CD8 se conservó bien. Las células preparadas de este modo, están listos para su uso en cultivos de células ex vivo o análisis de citometría de flujo. Este protocolo se ha empleado con éxito para el análisis de biopsias de piel individuales (4 mm) derivadas de la piel lesional de pacientes con psoriasis. Los resultados mostraron que las células T de la piel del paciente residente producen citoquinas inflamatorias como la más IL-17 y IFN en comparación con voluntarios sanos 9.
Protocol
Representative Results
Discussion
A continuación, se presenta un protocolo para aislar eficazmente las células T residentes de la piel a partir de biopsias de piel humana. La ventaja de este protocolo es el aislamiento de un número relativamente alto de linfocitos viables, y la expresión de marcadores de superficie correspondientes. Los subconjuntos de células identificadas fueron:, células CD4 + y linfocitos T CD8 + y CD25 + Foxp3 + CD11c + DCS. Es importante destacar que la cultura ex vi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
biopsias de piel de pacientes con psoriasis fueron amablemente proporcionados por el Dr. Andreas Koerber (departamento de Dermatología de la Universidad de Essen, Alemania) tras el consentimiento informado por escrito o por vía oral para uso científico.
XH también es apoyado por SNCF 61263039 y 11101321 SNCF.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Disposable Biopsy Punch | Kai Europe | BP-40F | 4 mm |
| Disposable sterile scalpels | Dalhausen | 1100000510 | |
| gentleMACS C tube | Miltenyi Biotech | 130-093-237 | Blue-capped, used as the dissociation tube. |
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotech | 130-093-235 | Automated tissue dissociator. Using the "program spleen_01" for dissociation of the skin biopsy. |
| Cell strainer | BD | 352350 | 70 µm nylon |
| 96-well U-bottom plate | Greiner Bio-One | 650180 | |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 22409-015 | |
| Sodium pyruvate | Life Technologies | 11360-039 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140-122 | |
| Human Pooled Serum (HPS) | in house prepared | ||
| Collagenase I | Sigma-Aldrich | C2674 | Type 1-A, suitable for cell culture |
| DNase I | Calbiochem | 260913 | |
| PBS | B Braun | 3623140 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A4503-500G | |
| Fixable Viability Dye (FVD) APC-eFluo780 | eBioscience | 65-0865-18 | Stain dead cells prior to cell fixation; dilute with PBS at 1:1000 |
| Fixation/Permeabilization Concentrate | eBioscience | 00-5123-43 | |
| Fixation/Permeabilization Diluent | eBioscience | 00-5223-56 | |
| Permeabilization Buffer (10x) | eBioscience | 00-8333-56 | |
| BV421 Mouse anti-human CD45 | BD | 563879 | Clone: HI30; dilution factor 1:50 |
| FITC Mouse anti-human CD14 | Dako | T0844 | Clone: TUK4; dilution factor 1:50 |
| PE Mouse anti-human CD56 | Dako | R7127 | Clone: MOC-1; dilution factor 1:50 |
| ECD Mouse anti-human CD3 | Beckman – Coulter | A07748 | Clone: UCHT1; dilution factor 1:50 for surface staining; dilution factor 1:25 for intracellular staining. |
| PC5.5 Mouse anti-human CD4 | Beckman – Coulter | B16491 | Clone: 13B8.2; dilution factor 1:200 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD11c | Beckman – Coulter | A80249 | Clone: BU15; dilution factor 1:50 |
| APC Mouse anti-human CD1c | Miltenyi Biotech | 130-090-903 | Clone: AD5-8E7; dilution factor 1:10 |
| APC-AlexFluo700 Mouse anti-human CD8 | Beckman – Coulter | A66332 | Clone: B9.11; dilution factor 1:400 |
| APC-AlexFluo750 Mouse anti-human CD19 | Beckman – Coulter | A94681 | Clone: J3-119; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human CD25 | eBioscience | AD5-8E7 | Clone: BC96; dilution factor 1:50 |
| PE Rat anti-human CLA | Miltenyi Biotech | 130-091-635 | clone: HECA-452; dilution factor 1: |
| eFluo450 Rat anti-human Foxp3 | eBIoscience | 48-4776-42 | Clone: PCH101; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| AlexFluo488 Mouse anti-human IL-17A | eBioscience | 53-7179-42 | Clone: eBio64DEC17; intracellular staining; dilution factor 1:50 |
| PeCy7 Mouse anti-human IFNg | eBioscience | 25-7319-41 | Clone: 4S.B3; intracellular staining; dilution factor 1:400 |
| Flow-Count Fluorospheres | Beckman – Coulter | 7547053 | Counting beads, for flow cytometry |
References
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