Or nanotige assistée stimulation optique des cellules neuronales
Summary
This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.
Abstract
Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.
Introduction
Des études récentes ont démontré que le chauffage transitoire associée à l'absorption de la lumière infrarouge par l'eau (longueur d'onde> 1400 nm) peut être utilisée pour induire des potentiels d'action dans le tissu nerveux et une transitoires calciques intracellulaires dans les cardiomyocytes 2. L'utilisation de la lumière infrarouge a soulevé un grand intérêt pour des applications dans les prothèses neurales, en raison de la résolution spatiale plus fine potentiel, l'absence de contact direct avec le tissu, la minimisation des artefacts de stimulation, et l'élimination de la nécessité de modifier génétiquement les cellules avant la stimulation ( le cas échéant en optogénétique) 1. Malgré tous ces avantages, les modèles thermiques récemment développés ont suggéré que les tissus / cellules cibles peuvent être affectés par les effets cumulatifs de chauffage, lorsque plusieurs sites de stimulation et / ou des taux de redoublement élevés sont utilisés 3,4.
En réponse à ces défis, les chercheurs ont reconnu le potentiel d'utiliser Absor extrinsèquebres pour la stimulation du nerf à produire des effets de chauffage plus localisées dans le tissu. Huang et al. A démontré ce principe en utilisant des nanoparticules de ferrite superparamagnétiques à activer à distance des canaux de TRPV1 sensibles à la température dans les cellules HEK 293 avec une haute fréquence de champ magnétique 5. Bien que cette technique peut permettre une pénétration plus profonde (champs magnétiques interagissent avec les tissus relativement faiblement), les réponses ont été enregistrées seulement sur des périodes de secondes, plutôt que les durées de millisecondes nécessaires dans les dispositifs bioniques 5. De même, Farah et al. Stimulation électrique démontré des neurones corticaux de rat avec des micro-particules noires in vitro. Ils ont montré une précision de niveau de cellule dans la stimulation en utilisant des durées d'impulsion de l'ordre de centaines de ps et des énergies de l'ordre de pJ, permettant potentiellement à des taux de redoublement plus rapides 6.
L'utilisation d'absorbeurs extrinsèques a également été appliquée pour induirechangements morphologiques in vitro. Ciofani et al. Ont montré une augmentation de ~ 40% de l'excroissance de cellules neuronales en utilisant piézoélectriques nanotubes de nitrure de bore excité par ultrasons 7. De même, les nanoparticules d'oxyde de fer endocytose dans les cellules PC12 ont été rapportés pour améliorer la différenciation des neurites d'une manière dépendante de la dose, du fait de l'activation des molécules d'adhésion cellulaire avec l'oxyde de fer 8.
Récemment, l'intérêt des absorbeurs extrinsèques pour aider la stimulation neuronale a également porté sur l'utilisation de nanoparticules d'or (Au IP). Au IP ont la capacité d'absorber efficacement la lumière laser au sommet plasmonique et de dissiper dans l'environnement sous forme de chaleur 9. Parmi toutes les formes de particules disponibles, l'absorption optique des nanotubes d'or (Au NR) correspond idéalement la fenêtre thérapeutique de tissus biologiques (proche infrarouge – NIR, longueur d'onde entre 750-1,400 nm) 10. En outre, dans la suiteposte de stimulation neurale, l'utilisation de Au NR fournit biocompatibilité relativement favorable et un large éventail d'options de fonctionnalisation de surface 11. Des études récentes ont montré que un effet stimulant sur la différenciation peut être induite après des expositions de laser continus de Au NR dans NG108-15 cellules neuronales 12. De même, les transitoires de calcium intracellulaire ont été enregistrées dans les cellules neuronales cultivées avec Au NR après l'irradiation laser modulé avec des fréquences variables et impulsions longueurs 13. dépolarisation de la membrane cellulaire a également été enregistrée après NIR éclairage laser de Au NRs dans des cultures primaires de neurones du ganglion spiral 14. Le premier dans la demande de vivo avec irradié Au NR a été démontrée récemment. Eom et ses collaborateurs exposés Au NR à leur apogée plasmonique et enregistré une multiplication par six de l'amplitude des potentiels d'action composé de nerf (CNAPS) et une diminution triple du seuil de stimulation chez le rat nerfs sciatiques. La sallediée réponse a été attribuée aux effets de chauffage locaux résultant de l'excitation du pic plasmonique NR 15.
Dans le présent document, protocoles pour enquêter sur les effets de la stimulation laser dans NG108-15 cellules neuronales cultivées avec l'UA NR sont spécifiés. Ces méthodes fournissent un simple, mais puissant, moyen pour irradier populations de cellules in vitro en utilisant des techniques et des matériaux biologiques standard. Le protocole est basé sur une diode laser à fibre couplé (LD) qui permet le fonctionnement en toute sécurité et d'alignement répétable. La préparation de l'échantillon et des méthodes d'irradiation laser Au NR peuvent être étendues à des formes de particules différentes et des cultures de cellules neuronales, pour autant que les protocoles de synthèse et de culture spécifiques sont connues, respectivement.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les protocoles décrits dans cette présentation décrivent comment la culture, différencier et optiquement stimuler les cellules neuronales en utilisant absorbeurs extrinsèques. Les caractéristiques de NR (par exemple, les dimensions, la forme, plasmon longueur d'onde de résonance et de la chimie de surface) et les paramètres de stimulation laser (tels que la longueur d'onde, durée d'impulsion, taux de redoublement, etc.) peuvent être modifiées pour correspondre à différents beso…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier NanoVentures l'Australie pour le soutien financier de Voyage et le professeur John Haycock pour avoir partiellement accueilli cette recherche à l'Université de Sheffield et Mme Jaimee Mayne pour son aide pendant le tournage.
Materials
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Equipment name | Company | Catalogue Number | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre – coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
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