זהב nanorod בסיוע גירוי אופטי של תאים עצביים
Summary
This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.
Abstract
Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.
Introduction
מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי החימום החולף הכרוכות בקליטה של אור אינפרא אדום על ידי מים (אורך הגל> 1,400 ננומטר) ניתן להשתמש כדי לגרום לפוטנציאל פעולה ברקמת עצב 1 וארעי סידן תוך תאי בשריר לב 2. השימוש באור אינפרא אדום העלה עניין רב עבור יישומים בתותבות עצביות, בשל הרזולוציה מרחבית עדינה הפוטנציאל, חוסר מגע ישיר עם הרקמות, מזעור של חפצי גירוי, והסרת הצורך לשנות גנטי את התאים לפני הגירוי ( כפי שנדרש בoptogenetics) 1. למרות כל היתרונות הללו, מודלים תרמיים שפותחו לאחרונה הציעו כי רקמת התאים / היעד עשויים להיות מושפעים מהשפעות מצטברות חימום, כאשר אתרי גירוי מרובים ו / או שיעורים גבוה חזרה משמשים 3,4.
בתגובה לאתגרים אלה, חוקרים זיהו את הפוטנציאל לשימוש חיצוני absorbers לגירוי עצב לייצר אפקטי חימום מקומיים יותר ברקמה. הואנג et al. הוכיח את העיקרון הזה על ידי שימוש בננו-חלקיקי פרית פאראמגנטי להפעיל מרחוק ערוצי TRPV1 רגיש לטמפרטורה בתאי HEK 293 עם תדר רדיו שדה מגנטי 5. למרות שטכניקה זו עשויה לאפשר לחדירה עמוקה יותר (שדות מגנטיים מגיבים יחסית חלש עם רקמה), התגובות נרשמו רק על פני תקופות של שניות, ולא המשכים אלפית השנייה הנדרשים במכשירי יונית 5. באופן דומה, פרח et al. גירוי חשמלי של תאי עצב בקליפת המוח הראה עכברוש עם מיקרו-חלקיקים שחורים במבחנה. הם הראו דיוק ברמת תא בגירוי באמצעות משכי דופק בסדר הגודל של מאות מייקרו-שני ואנרגיות בטווח של μJ, פוטנציאל המאפשרים לשיעורי חזרה מהירים יותר 6.
השימוש בבולמים חיצוניים גם הוחל לגרוםשינויים מורפולוגיים במבחנה. Ciofani et al. הראה עלייה ~ 40% בתולדת תאים עצביים באמצעות צינורות ניטריד בורון פיזואלקטריים נרגשים על ידי אולטרסאונד 7. בדומה לכך, חלקיקי תחמוצת ברזל endocytosed בתאי PC12 כבר דיווח על מנת לשפר את בידול neurite באופן תלוי מינון, בשל הפעלת מולקולות הידבקות תא עם תחמוצת ברזל 8.
לאחרונה, העניין בבולמים חיצוניים כדי לסייע גירוי עצבי גם התמקד בשימוש בננו-חלקיקי זהב (NPS Au). יש צירופים וAu היכולת לספוג ביעילות אור הלייזר בשיא plasmonic וכדי להפיג אותו לסביבה בצורה של חום 9. בין כל צורות חלקיקים הזמינות, הקליטה האופטית של ננו זהב (Au NRS) במקום נוח תואמת את החלון הטיפולי של רקמות ביולוגיות (ליד אינפרא אדום – ניר, גל בין 750-1,400 ננומטר) 10. יתר על כן, בהמשךשלוחה של גירוי עצבי, השימוש בAu NRS מספק biocompatibility נוח יחסית ומגוון רחב של אפשרויות functionalization משטח 11. מחקרים שנעשה לאחרונה הראו כי השפעה ממריצה על בידול יכולה להיגרם לאחר חשיפת לייזר רציפה של Au NRS בNG108-15 תאים עצביים 12. באופן דומה, הארעיים סידן תוך תאי נרשמו בתאים עצביים תרבית עם Au NRS אחרי הקרנת הלייזר מווסתת עם תדרים ודופק משתנים אורכי 13. שלילת קוטביות קרום תא נרשמה גם לאחר תאורת לייזר NIR של Au NRS בתרבויות עיקריות של נוירונים הגנגליון ספירלה 14. הראשון ביישום vivo עם מוקרן Au NRS הודגם רק לאחרונה. משקיפים ועמיתים לעבודה נחשפו Au NRS בשיא plasmonic ונרשמו עלייה של פי שש במשרעת של פוטנציאל פעולה עצבי מתחם (CNAPs) וירידה של פי שלושה בסף הגירוי בעצבי sciatic חולדה. Enתגובה חל שיפורים יוחסה להשפעות חימום מקומיות כתוצאה מהעירור של שיא plasmonic NR 15.
בעבודה הנוכחית, פרוטוקולים לבודקים את ההשפעה של גירוי הלייזר בNG108-15 תאים עצביים תרבית עם NRS Au מפורטים. שיטות אלה מספקות, דרך פשוטה, אך רבת עוצמה כדי להקרין אוכלוסיות תאים במבחנה תוך שימוש בטכניקות ביולוגיות סטנדרטיים וחומרים. הפרוטוקול מבוסס על דיודות לייזר בשילוב סיבים (LD), המאפשרת הפעלה בטוחה ויישור הדיר. שיטות הקרנת הכנת מדגם ולייזר Au NR ניתן להאריך עוד יותר לצורות שונות של חלקיקים ותרביות תאים עצביים, ובלבד שפרוטוקולי הסינתזה והתרבות הספציפיים ידועים, בהתאמה.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקולים מפורטים במצגת זו מתארים כיצד תרבות, להבדיל ואופטי לעורר תאים עצביים באמצעות בולמים חיצוניים. מאפייני NR (למשל ממדים, צורה, אורך גל תהודת plasmon וכימיה של פני השטח) ופרמטרי גירוי לייזר (כגון אורך גל, אורך הפולס, שיעור החזרה, וכו ') יכולים להיות מגוון ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות NanoVentures אוסטרליה לתמיכה במימון הנסיעות ופרופ 'ג'ון כובע על שארח באופן חלקי מחקר זה באוניברסיטת שפילד והגב' Jaimee Mayne על עזרתה בזמן הצילומים.
Materials
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Equipment name | Company | Catalogue Number | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre – coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
References
- Richter, C. P., Matic, A. I., Wells, J. D., Jansen, E. D., Walsh, J. T. Neural stimulation with optical radiation. Laser. Photonics Rev. 5 (1), 68-80 (2011).
- Dittami, G. M., Rajguru, S. M., Lasher, R. A., Hitchcock, R. W., Rabbitt, R. D. Intracellular calcium transients evoked by pulsed infrared radiation in neonatal cardiomyocytes. J. Physiol. 589 (6), 1295-1306 (2011).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Brown, W. G. A., Stoddart, P. R. Modeling of light absorption in tissue during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 17 (7), 075002-075002 (2012).
- Thompson, A. C., Wade, S. A., Cadusch, P. J., Brown, W. G., Stoddart, P. R. Modeling of the temporal effects of heating during infrared neural stimulation. J. Biomed. Opt. 18 (3), 035004 (2013).
- Huang, H., Delikanli, S., Zeng, H., Ferkey, D. M., Pralle, A. Remote control of ion channels and neurons through magnetic-field heating of nanoparticles. Nat. Nanotechnol. 5 (8), 602-606 (2010).
- Farah, N., et al. Holographically patterned activation using photo-absorber induced neural-thermal stimulation. J. Neural. Eng. 10 (5), (2013).
- Ciofani, G., et al. Enhancement of neurite outgrowth in neuronal-like cells following boron nitride nanotube-mediated stimulation. ACS Nano. 4 (10), 6267-6277 (2010).
- Kim, J. A., et al. Enhancement of neurite outgrowth in PC12 cells by iron oxide nanoparticles. Biomaterials. 32 (11), 2871-2877 (2011).
- Myroshnychenko, V., et al. Modelling the optical response of gold nanoparticles. Chem. Soc. Rev. 37 (9), 1792-1805 (2008).
- Choi, W. I., Sahu, A., Kim, Y. H., Tae, G. Photothermal cancer therapy and imaging based on gold nanorods. Ann. Biomed. Eng. 40 (2), 534-546 (2011).
- Zhan, Q., Qian, J., Li, X., He, S. A study of mesoporous silica-encapsulated gold nanorods as enhanced light scattering probes for cancer cell imaging. Nanotechnology. 21 (5), 055704 (2010).
- Paviolo, C., et al. Laser exposure of gold nanorods can increase neuronal cell outgrowth. Biotechnol. Bioeng. 110 (8), 2277-2291 (2013).
- Paviolo, C., Haycock, J. W., Cadusch, P. J., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Laser exposure of gold nanorods can induce intracellular calcium transients. J. Biophotonics. 7 (10), 761-765 (2014).
- Yong, J., et al. Gold-nanorod-assisted near-infrared stimulation of primary auditory neurons. Adv. Healthcare Mater. , (2014).
- Eom, K., et al. Enhanced infrared neural stimulation using localized surface plasmon resonance of gold nanorods. Small. , (2014).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L. M., Mulvaney, P. Gold nanorods: Synthesis, characterization and applications. Coordination Chemistry Reviews. (17-18), 1870-1901 (2005).
- Shang, J., Gao, X. Nanoparticle counting: towards accurate determination of the molar concentration. Chem. Soc. Rev. 43 (21), 7267-7278 (2014).
- Sharma, V., Park, K., Srinivasarao, M. Shape separation of gold nanorods using centrifugation. Proc. Natl. Acad. Sci. 106 (13), 4981-4985 (2009).
- Kaewkhaw, R., Scutt, A. M., Haycock, J. W. Anatomical site influences the differentiation of adipose-derived stem cells for schwann-cell phenotype and function. Glia. 59 (5), 734-749 (2011).
- Brown, W. G. A., Needham, K., Nayagam, B. A., Stoddart, P. R. Whole cell patch clamp for investigating the mechanisms of infrared neural stimulation. JoVE. (77), (2013).
- Cadusch, P. J., Hlaing, M. M., Wade, S. A., McArthur, S. L., Stoddart, P. R. Improved methods for fluorescence background subtraction from Raman spectra. J. Raman Spectrosc. 44 (11), 1587-1595 (2013).
- Daud, M. F. B., Pawar, K. C., Claeyssens, F., Ryan, A. J., Haycock, J. W. An aligned 3D neuronal-glial co-culture model for peripheral nerve studies. Biomaterials. 33 (25), 5901-5913 (2012).
- Jung, S., et al. Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain. PLoS ONE. 9 (3), e91360 (2014).
- Salinas, K., Kereselidze, Z., DeLuna, F., Peralta, X., Santamaria, F. Transient extracellular application of gold nanostars increases hippocampal neuronal activity. J. Nanobiotechnology. 12 (1), 31 (2014).
- Ebbesen, C. L., Bruus, H. Analysis of laser-induced heating in optical neuronal guidance. J. Neurosci. Meth. 209 (1), 168-177 (2012).
- Iwanaga, S., et al. Location-dependent photogeneration of calcium waves in HeLa cells. Cell Biochem. Biophys. 45 (2), 167-176 (2006).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Determination of the minimum temperature required for selective photothermal destruction of cancer cells with the use of immunotargeted gold nanoparticles. Photochem. Photobiol. 82 (2), 412-417 (2006).
- Connor, E. E., Mwamuka, J., Gole, A., Murphy, C. J., Wyatt, M. D. Gold nanoparticles are taken up by human cells but do not cause acute cytotoxicity. Small. 1 (3), 325-327 (2005).
- Isomaa, B., Reuter, J., Djupsund, B. M. The subacute and chronic toxicity of cetyltrimethylammonium bromide (CTAB), a cationic surfactant, in the rat. Arch. Toxicol. 35 (2), 91-96 (1976).
- Juste, J., Pastoriza-Santos, I., Liz-Marzán, L., Mulvaney, P. Gold nanorods: synthesis, characterization and applications. Coord. Chem. Rev. 249 (17-18), 1870-1901 (2005).
- Dreaden, E. C., Alkilany, A. M., Huang, X., Murphy, C. J., El-Sayed, M. A. The golden age: gold nanoparticles for biomedicine. Chem. Soc. Rev. 41 (7), 2740-2779 (2012).
- Huang, X., Jain, P. K., El-Sayed, I. H., El-Sayed, M. A. Plasmonic photothermal therapy (PPTT) using gold nanoparticles. Lasers Med. Sci. 23 (3), 217-228 (2008).
- Albert, E. S., et al. TRPV4 channels mediate the infrared laser-evoked response in sensory neurons. J. Neurophysiol. 107 (12), 3227-3234 (2012).
- Garcia-Elias, A., et al. Phosphatidylinositol-4,5-biphosphate-dependent rearrangement of TRPV4 cytosolic tails enables channel activation by physiological stimuli. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (23), 9553-9558 (2013).
- Shapiro, M. G., Homma, K., Villarreal, S., Richter, C. -. P., Bezanilla, F. Infrared light excites cells by changing their electrical capacitance. Nat. Commun. 3 (736), (2012).
- Roggan, A., Friebel, M., Dörschel, K., Hahn, A., Müller, G. Optical properties of circulating human blood in the wavelength range 400-2500 nm. J. Biomed. Opt. 4 (1), 36-46 (1999).
- Byrnes, K. R., et al. Light promotes regeneration and functional recovery and alters the immune response after spinal cord injury. Lasers Surg. Med. 36 (3), 171-185 (2005).
- Wu, X., et al. 810 nm wavelength light: an effective therapy for transected or contused rat spinal cord. Lasers Surg. Med. 41 (1), 36-41 (2009).
- Grossman, N., Schneid, N., Reuveni, H., Halevy, S., Lubart, R. 780 nm low power diode laser irradiation stimulates proliferation of keratinocyte cultures: involvement of reactive oxygen species. Lasers Surg. Med. 22 (4), 212-218 (1998).
- Wong-Riley, M. T. T., et al. Photobiomodulation directly benefits primary neurons functionally inactivated by toxins – Role of cytochrome c oxidase. J. Biol. Chem. 280 (6), 4761-4771 (2005).
- Beauvoit, B., Kitai, T., Chance, B. Contribution of the mitochondrial compartment to the optical properties pf the rat liver: a theoretical and practical approach. Biophys. J. 67 (6), 2501-2510 (1994).
