Ouro nanorod assistida estimulação óptica de Neuronal Cells
Summary
This protocol outlines how to use the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods to stimulate differentiation and intracellular calcium activity in neuronal cells. These results potentially open up new applications in neural prostheses and fundamental studies in neuroscience.
Abstract
Recent studies have demonstrated that nerves can be stimulated in a variety of ways by the transient heating associated with the absorption of infrared light by water in neuronal tissue. This technique holds great potential for replacing or complementing standard stimulation techniques, due to the potential for increased localization of the stimulus and minimization of mechanical contact with the tissue. However, optical approaches are limited by the inability of visible light to penetrate deep into tissues. Moreover, thermal modelling suggests that cumulative heating effects might be potentially hazardous when multiple stimulus sites or high laser repetition rates are used. The protocol outlined below describes an enhanced approach to the infrared stimulation of neuronal cells. The underlying mechanism is based on the transient heating associated with the optical absorption of gold nanorods, which can cause triggering of neuronal cell differentiation and increased levels of intracellular calcium activity. These results demonstrate that nanoparticle absorbers can enhance and/or replace the process of infrared neural stimulation based on water absorption, with potential for future applications in neural prostheses and cell therapies.
Introduction
Estudos recentes têm demonstrado que o aquecimento transitória associada com a absorção de luz infravermelha por água (comprimento de onda> 1400 nm) pode ser utilizado para induzir potenciais de acção em tecidos nervosos 1 e transientes de cálcio intracelular em cardiomiócitos 2. A utilização de luz infravermelha tem suscitado grande interesse para aplicações em próteses neurais, devido ao potencial de resolução espacial mais fina, a falta de um contacto directo com o tecido, a minimização de artefactos de estimulação, e remoção da necessidade de modificar geneticamente as células antes da estimulação ( conforme exigido no optogenética) 1. Apesar de todas estas vantagens, os modelos térmicos desenvolvidos recentemente sugerido que os tecidos / células-alvo pode ser afectada por efeitos cumulativos de aquecimento, quando vários sítios de estímulo e / ou elevadas taxas de repetição são utilizados 3,4.
Em resposta a estes desafios, os pesquisadores têm reconhecido o potencial de usar unidade de absorvância extrínsecabros para a estimulação do nervo para produzir efeitos de aquecimento mais localizadas no tecido. Huang et al. Demonstrou esse princípio usando nanopartículas de ferrita superparamagnéticos para ativar remotamente os canais TRPV1 sensíveis à temperatura em células HEK 293 com um campo magnético 5 de rádio-freqüência. Embora esta técnica pode permitir a penetração mais profunda (campos magnéticos relativamente interagem fracamente com o tecido), apenas as respostas foram registadas ao longo de períodos de segundos, em vez de as durações milissegundo necessários em dispositivos biônicos 5. Da mesma forma, Farah et al. Estimulação elétrica demonstrada de neurônios corticais de ratos com micro-partículas negras em vitro. Eles mostraram precisão em nível celular em estimulação usando durações de pulso na ordem de centenas de ms e energias na faixa de μJ, potencialmente permitindo que as taxas de repetência mais rápidos 6.
A utilização de absorventes extrínsecos também foi aplicado para induziralterações morfológicas in vitro. Ciofani et al. Mostrou um aumento de ~ 40% no crescimento de células neuronais usando nanotubos de nitreto de boro piezoelétricos excitados por ultra-som 7. Da mesma forma, nanopartículas de óxido de ferro endocitose nas células PC12 têm sido relatados para aumentar a diferenciação de neurites de uma forma dependente da dose, devido à activação de moléculas de adesão celular, com o óxido de ferro 8.
Recentemente, o interesse em absorvedores extrínsecos para ajudar a estimulação neural também centrou-se na utilização de nanopartículas de ouro (Au NPS). Au NPs têm a capacidade de absorver a luz laser de forma eficiente no pico plasmónico e dissipar para o ambiente circundante em forma de calor 9. Entre todas as formas de partículas disponíveis, a absorção óptica do nanorods ouro (Au NRs) corresponde convenientemente a janela terapêutica de tecidos biológicos (infravermelho próximo – NIR, comprimento de onda entre 750-1,400 nm) 10. Além disso, no context de estimulação neural, o uso de Au NRs proporciona biocompatibilidade relativamente favoráveis e uma grande variedade de opções de funcionalização de superfície 11. Estudos recentes têm mostrado que um efeito estimulador sobre a diferenciação pode ser induzida após exposições a laser contínua de Au NRs NG 108-15 em células neuronais 12. Da mesma forma, os transientes de cálcio intracelular foram registrados em células neuronais cultivadas com Au NRs após a irradiação com laser modulado com freqüências variáveis e pulso comprimentos 13. Despolarização da membrana celular também foi registada após iluminação por laser NIR de Au NRs em culturas primárias de neurónios do gânglio da espiral 14. A primeira aplicação in vivo com irradiado Au NRs foi demonstrado recentemente. Eom e colegas de trabalho expostos Au NRs em seu pico plasmonic e registrou um aumento de seis vezes na amplitude do potencial de ação do nervo composto (CNaPS) e uma diminuição de três vezes no limiar de estimulação no nervo ciático de ratos. O enresposta hanced foi atribuído a efeitos de aquecimento local que resultam da excitação do pico plasmónico NR 15.
No presente trabalho, protocolos para investigar os efeitos da estimulação do laser em NG108-15 células neuronais cultivadas com Au NRs são especificados. Esses métodos fornecem um simples, mas poderoso, caminho para irradiar populações de células in vitro utilizando técnicas de biologia padrão e materiais. O protocolo baseia-se em um diodo laser acoplada a fibra (LD) que permite um funcionamento seguro e repetitivo alinhamento. As Au NR preparação de amostras e métodos de irradiação a laser pode ser alargada a diferentes formas de partículas e culturas de células neuronais, proporcionando que os protocolos de síntese e de cultura específicos são conhecidos, respectivamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os protocolos descritos nesta apresentação descrevem como cultura, diferenciar e opticamente estimular as células neuronais usando absorventes extrínsecos. As características NR (por exemplo, dimensões, forma, comprimento de onda de ressonância de plasmon de superfície e química) e os parâmetros de estimulação do laser (comprimento de onda, tais como, duração dos impulsos, taxa de repetição, etc.) pode ser variada para corresponder a diferentes necessidades experimentais. Os efeitos sob…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer NanoVentures Austrália por apoio de financiamento de viagens e Prof. John Haycock por ter sido sede parcialmente esta pesquisa da Universidade de Sheffield e Ms. Jaimee Mayne por sua ajuda durante as filmagens.
Materials
| Au NR | Sigma Aldrich | 716812 | |
| NG108-15 | Sigma Aldrich | 8811230 | |
| DMEM | Sigma Aldrich | D6546 | |
| FCS | Life Technologies | 10100147 | |
| L-glutamine | Sigma Aldrich | G7513 | |
| Penicillin/streptomycin | Life Technologies | 15140122 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290018 | |
| Formaldehyde | Sigma Aldrich | F8775 | |
| Triton X-100 | BDH | T8532 | |
| BSA | Sigma Aldrich | A2058 | |
| Anti-βIII-tubulin | Promega | G7121 | |
| TRITC-conjugated anti-mouse IgG antibody | Sigma Aldrich | T5393 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | |
| Fluo-4 AM | Invitrogen | F14201 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | 472301 | |
| Pluronic F-127 | Invitrogen | P6867 | |
| Equipment name | Company | Catalogue Number | |
| UV-Vis spectrometer | Varian Medical Systems Inc. | Cary 50 Bio | |
| Mini centrifuge | Eppendorf | Mini Spin | |
| Sonic bath | Unisonics Australia | FPX 10D | |
| Cell culture incubator | Kendro | Hera Cell 150 | |
| Cell culture centrifuge | Hettich | Rotofix 32A | |
| Laser diode | Optotech | 780 nm single mode fibre – coupled LD | |
| Optical fiber | Thorlabs | 780 HP | |
| Power meter | Coherent | Laser Check | |
| ImageJ | http://rsb.info.nih.gov/ij/index.html | ||
| Epifluorescent microscope | Axon Instruments | ImageX-press 5000A | |
| μ-slide well | Ibidi | 80826 | |
| Inverted confocal microscope | Carl Zeiss Microscopy Ltd. | LSM 510 meta-confocal microscope | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS210 |
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