Lepr<sup> Db</sup> Modelo de ratón de la Diabetes Tipo 2: El aislamiento de los islotes pancreáticos y células en Vivo 2-Photon imágenes de islotes intactos
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
La diabetes tipo 2 es una enfermedad crónica que afecta a 382 millones de personas en 2013, y se espera que aumente a 592 millones en 2035 1. Durante las últimas 2 décadas, el papel de la disfunción de las células beta en la diabetes tipo 2 se ha establecido claramente 2. Progreso de la investigación ha requerido métodos para el aislamiento de islotes pancreáticos. El protocolo del aislamiento de islotes presenta aquí comparte muchos pasos comunes con protocolos de otros grupos, con algunas modificaciones para mejorar el rendimiento y la calidad de los islotes aislados de tanto el tipo silvestre y db Lepr diabéticos (db / db) ratones. Un método de formación de imágenes 2-fotón de células vivas se presenta entonces que se puede utilizar para investigar el control de la secreción de insulina en islotes.
Introduction
El papel de la disfunción de las células beta en la enfermedad ha sido ampliamente reconocida 3,4. Las líneas celulares como el MIN6 e INS-1 son herramientas útiles para entender la biología del comportamiento de las células beta. Sin embargo, el control fisiológico de la secreción de insulina tiene lugar dentro de los islotes de Langerhans. Estos islotes contienen miles de células beta apretadas, así como los vasos sanguíneos y otros tipos de células endocrinas. Este entorno dentro del islote influye en la secreción de insulina y es probable que sea importante en la diabetes. Por lo tanto, para entender el control fisiológico de la secreción de insulina, y la fisiopatología de la enfermedad, es esencial para estudiar islotes intactos.
Aislamiento Islet
Islotes humanos vivos y, en particular, islotes humanos de los pacientes con diabetes tipo 2 son difíciles de obtener. Además, islotes humanos tienen limitadas posibilidades de manipulación molecular experimental. Por lo tanto, los investigadores han empleado esdeja de animales y modelos animales de diabetes tipo 2. Uno de estos modelos de la enfermedad es el ratón db / db. Esta es una mutación espontánea que los modelos de la diabetes tipo 2 con una progresión fenotipo que se asemeja mucho a la enfermedad humana 5,6. El protocolo que aquí se presenta para el aislamiento de los islotes de los ratones db / db diabéticos tiene muchos pasos en común con otros grupos con algunas opciones de mejor rendimiento, depuración y mejora la supervivencia de los islotes.
Imagen 2 de fotones
El ensayo de 2 fotones de células vivas se describe aquí permite a los investigadores para cuantificar el número y evaluar las características de los gránulos individuales que contiene insulina de muchas células del diabético 7 y de tipo salvaje islotes 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
El factor más crítico en el aislamiento de islotes es la perfusión inicial del páncreas; un bajo perfundido páncreas resultados con un rendimiento de islotes considerablemente menor. Otros factores también afectan a la calidad de aislamiento tales como el tiempo de digestión y el nivel de agitación que podría compensar en parte el nivel de perfusión. Por ejemplo, tendrá que ser incubaron a 37 ° C durante ~ 18 min 30 sec mientras se agitaba suavemente, en un contraste bajo digerido páncreas pueden requerir ~…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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