Lepr<sup> Db</sup> Mausmodell des Typ-2-Diabetes: Pancreatic Islet Isolation und Live-cell 2-Photonen-Imaging von intakten Inseln
Summary
We present here a protocol for the isolation of islets from the mouse model of type 2 diabetes, Leprdb and details of a live-cell assay for measurement of insulin secretion from intact islets that utilizes 2 photon microscopy.
Abstract
Typ 2-Diabetes ist eine chronische Krankheit, die 382 Millionen Menschen im Jahr 2013 und wird voraussichtlich bis zu 592 Mio. im Jahr 2035 1 steigen. In den letzten 2 Jahrzehnten die Rolle der Beta-Zell-Dysfunktion bei Typ 2 Diabetes wurde klar festgelegt 2. Forschung Fortschritte Methoden zur Isolierung von Langerhans-Inseln erforderlich. Das Protokoll der Inselisolierung hier präsentierten viele gemeinsame Schritte mit Protokollen von anderen Gruppen, mit einigen Änderungen, um die Ausbeute und Qualität der isolierten Inseln sowohl aus dem Wildtyp und diabetischen Lepr db (db / db) Mäusen zu verbessern. Ein Live-Zelle der 2-Photonen-Abbildungsverfahren wird dann präsentiert, die verwendet werden können, um die Kontrolle der Insulinsekretion in Inseln zu untersuchen.
Introduction
Die Rolle der Betazelldysfunktion bei Krankheiten ist allgemein anerkannt, 3,4. Zelllinien, wie der MIN6 und INS-1 sind nützliche Werkzeuge, um die Biologie von Beta-Zell-Verhalten zu verstehen. Allerdings ist die physiologische Kontrolle der Insulinsekretion findet innerhalb der Langerhans-Inseln. Diese Inseln enthalten Tausenden eng gepackten Beta-Zellen, sowie Blutgefäße und anderen endokrinen Zelltypen. Diese Umgebung innerhalb des Insel beeinflusst Insulinsekretion und dürfte bei Diabetes wichtig. Um daher die physiologischen Kontrolle der Insulinsekretion und die Pathophysiologie der Erkrankung zu verstehen, ist es wichtig, intakte Inseln studieren.
Inselisolierung
Live menschlichen Inselchen und insbesondere menschlichen Inselzellen vom Typ 2-Diabetes-Patienten sind schwer zu bekommen. Darüber hinaus haben die menschliche Inselzellen begrenzte Möglichkeiten für experimentelle molekulare Manipulation. Forscher haben daher eingesetztekönnen aus Tieren und Tiermodellen des Typ 2 Diabetes. Ein solcher Krankheitsmodell ist der db / db-Maus. Dies ist eine spontane Mutation, die Models Typ-2-Diabetes mit einem Phänotyp Progression, die menschliche Krankheit 5,6 eng Parallelen. Die für die Inselisolierung aus diabetischen db / db Mäusen hier vorgestellten Protokoll hat viele Schritte gemeinsam mit anderen Gruppen mit einigen Verfeinerungen für bessere Ausbeute, Reinigung und verbesserte Insellebens.
2 Photonen-Imaging
Die Live-cell 2-Photonen-Assay hier beschriebenen ermöglicht es Forschern, um die Anzahl zu quantifizieren und zu bewerten die Merkmale der einzelnen insulinhaltigen Granulat aus vielen Zellen der diabetischen 7 und Wildtyp-Inselchen 8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
Der wichtigste Faktor für die Inselisolierung ist die anfängliche Durchblutung des Pankreas; ein unter perfundierten Pankreas führt zu einem erheblich niedrigeren Inselausbeute. Andere Faktoren, die auch Auswirkungen auf die Isolierung Qualität wie die Aufschlusszeit und der Höhe der Erschütterung, die teilweise für die Höhe der Durchblutung zu kompensieren könnte. Zum Beispiel wird ein voll durchströmten Bauchspeicheldrüse müssen bei 37 ° C für ~ 18 min 30 sec inkubiert werden unter leichtem Schütteln im…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Australian Research Council Grant DP110100642 (to PT) and National Health and Medical Research Council Grants APP1002520 and APP1059426 (to PT and HYG).
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Liberase TL 5mg | Roche | -5401020001 | |
| Collagenase type IV-1g | Gibco-Life Technologies | 17104-019 | |
| Histopaque 1077 500ml | Sigma Aldrich | 10771 | |
| RPMI 1640 Medium (10X) 1L | Sigma Aldrich | R1383 | to prepare isolation media |
| RPMI 1640 (1X) 500ml | Gibco-Life Technologies | 21870-076 | to prepare cultured media |
| Penicillin-Streptomycin 100ml | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | to prepare cultured media |
| Fetal bovine serum 500ml | Gibco-Life Technologies | 10099-141 | to prepare cultured media |
| DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) | Gibco-Life Technologies | 11966-025 | to dilute the liberase |
| Metamorph program | Molecular Devices, USA | to analyze the 2-photon images |
References
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