Valutazione del tumore infiltrante leucociti sottoinsiemi in un tumore sottocutaneo modello
Summary
This protocol describes a method for the detailed evaluation of leukocyte subsets within the tumor microenvironment in a mouse tumor model. Chemerin-expressing B16 melanoma cells were implanted subcutaneously into syngeneic mice. Cells from the tumor microenvironment were then stained and analyzed by flow cytometry, allowing for detailed leukocyte subset analyses.
Abstract
Cellule immunitarie specializzate che infiltrano il microambiente tumorale regolano la crescita e la sopravvivenza di neoplasia. Le cellule maligne devono eludere o sovvertire antitumorali risposte immunitarie per sopravvivere e prosperare. Tumori approfittare di una serie di diversi meccanismi di immune "fuga", tra cui l'assunzione di tollerogenico DC, cellule T regolatorie immunosoppressori (Tregs), e le cellule mieloidi soppressori di derivazione (MDSC) che inibiscono le risposte antitumorali citotossici. Al contrario, le cellule immunitarie anti-tumorale effettrici possono rallentare la crescita e l'espansione di tumori maligni: cellule dendritiche immunostimolante, cellule killer naturali che ospitano innata immunità anti-tumorale, e le cellule T citotossiche tutti possono partecipare alla soppressione del tumore. L'equilibrio tra pro e anti-tumorali leucociti determina in ultima analisi, il comportamento e il destino delle cellule trasformate; una moltitudine di studi clinici umani hanno portato questo fuori. Pertanto, l'analisi dettagliata di sottoinsiemi di leucociti all'internomicroambiente tumorale è diventato sempre più importante. Qui, si descrive un metodo per analizzare sottoinsiemi di leucociti infiltranti presenti nel microambiente tumorale in un modello di tumore del mouse. Cellule tumorali di melanoma mouse B16 sono state inoculate sottocute in topi C57BL / 6. In un periodo di tempo specificato, i tumori e la pelle circostante sono stati asportati in blocco e trasformati in sospensioni di cellule singole, che sono stati poi macchiati per il multi-color citometria a flusso. Utilizzando una varietà di marcatori leucociti sottoinsieme, siamo stati in grado di confrontare le relative percentuali di infiltrazione sottoinsiemi di leucociti tra controllo e tumori chemerina esprimono. Gli investigatori possono utilizzare tale strumento per studiare la presenza immunitaria nel microambiente tumorale e quando combinato con le misure tradizionali di dimensioni pinza di crescita tumorale, potenzialmente permetterà loro per chiarire l'impatto dei cambiamenti in composizione immune sulla crescita tumorale. Tale tecnica può essere applicata a qualsiasi modello di tumore in cui il tumore ed il suo microambiente cun essere asportato e trattati.
Introduction
L'equilibrio tra la crescita del tumore e la promozione e la regressione è, in parte, dipende l'equilibrio del tumore infiltrante leucociti pro- e anti presenti nel microambiente 1,2. Per studiare il microambiente tumorale (TME) e in particolare individuare le sottopopolazioni di leucociti infiltrante, abbiamo sviluppato un metodo per la valutazione dei tumori sottocutanei in un modello murino di tumore. L'importanza di studiare il microambiente tumorale è ben noto e supportato in letteratura. Numerosi studi hanno dimostrato che l'equilibrio delle cellule immunitarie pro e anti-tumorali infiltranti può influire i risultati di crescita del tumore, non solo nel topo, ma anche studi sull'uomo (recensito in 3,4). Ad esempio, Curiel et al. Hanno dimostrato che hanno peggiorato i risultati clinici nei pazienti con tumore ovarico sono stati correlati con la presenza di percentuali crescenti di regolamentazione cellule T CD4 + infiltranti il tumore (Tregs) 5. Il nostro lavoro ha dimostrato l'effetto di un novel leucociti chemiotattico sul rapporto di sottoinsiemi di leucociti in un modello murino di melanoma 6, che anche correlata con diminuita crescita tumorale. Pertanto, le analisi dettagliate dei sottoinsiemi dei leucociti in un tumore è ora più ampiamente riconosciuto e sempre più importante.
Ci sono molti modi per valutare il microambiente tumorale per infiltrazione leucociti; per esempio gruppi hanno ingegnerizzato topi transgenici per esprimere diverse proteine fluorescenti al fine di immagine TME 7, immunoistochimica classica e immunofluorescenza di sezioni conservate 8, comprese varie modalità di imaging quali MRI, PET, la microscopia confocale 9-11 – alcuni con la capacità di monitorare intravitally 10,12. Questi possono essere utilizzati con vari agenti di imaging molecolare, come nanoparticelle 13 o nuovi agenti di contrasto 14 che etichetta cellule immunitarie. Il nostro metodo è un approccio basato citometria di flusso e presenta diversi vantaggi.In primo luogo, l'intero microambiente tumorale può essere campionato; al momento dell'analisi, l'intero tumore sottocutaneo e periferia circostante è chirurgicamente asportati per l'elaborazione. Ciò elimina qualsiasi polarizzazione potenzialmente campionamento all'interno di un singolo tumore e dà un'analisi più "globale" del tumore nel suo complesso. In secondo luogo, noi utilizzando il flusso multicolor citometria di analizzare i sottoinsiemi di leucociti permette di valutare più specificamente il fenotipo dei leucociti infiltranti. A seconda del numero di colori usati, sottoinsiemi molto specifici possono essere identificati. Questo è importante in quanto vi sono diversi sottoinsiemi dei leucociti all'interno di un particolare tipo di cellule – o anche in una classifica generale sottotipo – che hanno funzioni diverse che sono potenzialmente significativo nel determinare il destino del tumore. Ad esempio, le cellule dendritiche plasmacitoidi (PDC) sono stati implicati in antitumorale immunità 15. Tuttavia, il sottoinsieme CCR9 + di pDC ha dimostrato di essere tollerogenico 16, e spostando il balance di tale sottoinsieme può avere un impatto sulla crescita tumorale.
Il nostro metodo è appropriato per sottocutanea o altri tumori che possono essere asportate in blocco. Nelle nostre mani, tumori sono stati uniformemente resecati al momento della eutanasia. Tuttavia, è concepibile, come è stato fatto in alcuni studi, che un tumore sottocutaneo potrebbe essere completamente asportato con chiusura della pelle circostante in una chirurgia di sopravvivenza 17, consentendo così la valutazione ulteriore dell'animale. L'analisi viene quindi eseguita sul tumore resecato. Pertanto, i risultati rappresentano un unico tempo di valutazione nello sviluppo del tumore. Mentre questo permette uno sguardo dettagliato nel microambiente, è anche un'immagine statica di ciò che è senza dubbio un processo dinamico. Tuttavia, leucociti isolati (ad esempio via magnetico separazione o gradiente di densità) possono poi essere analizzati separatamente dal epiteli tumore e stroma, o utilizzati in altri, saggi funzionali per definire ulteriormente la loro fenotipo, come è stato previdentemente descritto 18. Questo metodo, quindi, sarebbe utile per eventuali investigatori interessati a comprendere la composizione dei leucociti all'interno del microambiente tumorale in un dato punto di tempo, sia nella cornice del corso malattia naturale, o dopo uno specifico perturbazione terapeutica. Sebbene non sia fatto da noi, variazioni di questo procedimento potrebbe anche potenzialmente essere utilizzati per analizzare porzioni specifiche di un tumore in isolamento. Ad esempio, date le dimensioni del tumore, la zona periferica (s) può essere scisso dalla centrale, eventualmente nucleo necrotico del tumore per dare il ricercatore una visione più spazialmente segregati del microambiente tumorale.
Nel settore in rapida crescita del tumore immunologia, non ci sarà senza dubbio un numero esponenzialmente crescente di studi che valutano nuovi agenti immunomodulatori in modelli tumorali murini. Diversi studi hanno messo in evidenza le differenze in funzione dei leucociti specifica all'interno del tumore rispetto al periferico enbiente. Ad esempio, Shafer-Weaver et al. Ha dimostrato in un modello murino che CD8 + cellule T antigene-specifica effettrici, mentre attiva in periferia, sono state trasformate in cellule soppressori CD8 + T, una volta vittime della tratta nel microambiente tumorale 19. Questo è stato in parte dovuto al TGFβ, ma altri fattori sono probabilmente coinvolti pure. Pertanto, la valutazione sottoinsiemi leucociti – numeri e rapporti, nonché lo stato funzionale – entro il tumore stesso darà una rappresentazione più accurata degli effetti di un particolare immunomodulazione sul destino tumore.
La nostra tecnica permette un'analisi dettagliata del tumore e fornisce il ricercatore la possibilità di individuare più da vicino i cambiamenti nelle popolazioni di leucociti che approcci precedenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Esecuzione di analisi dettagliata del microambiente tumorale è fondamentale nel determinare i meccanismi e gli effetti di immunomodulazione. Con la crescente presenza di immunotherapeutics nel regno clinico umano, comprendere l'impatto di questi agenti sui leucociti infiltranti il tumore sta diventando necessaria per definire il loro meccanismo d'azione. Negli esseri umani, esistono spesso difficoltà cliniche e / o logistiche nell'ottenere e analizzando tessuto tumorale per l'analisi dei leucocit…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni R01-CA169354 e R01-047822 dal National Institutes of Health e un Merit Award dal Department of Veterans Affairs (BCE). RKP è stato sostenuto da NIH T32 CA009287-30A1, un ASCO Young Investigator Award, California Breast Cancer Research Fellowship progetto, e un American Cancer Society Mentored Research Scholar di Grant; BAZ è stato sostenuto da NIH concedere AI079320. JM è stato sostenuto da borse di NIH T-32 borsa di formazione T32-AI07290- 25, T32-AI07290-24 e American Cancer Society borsa di studio post-dottorato PF-12-052-01-CSM.
Materials
| Name of the Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| RPMI | Cellgro | 10-040 | http://cellgro.com; keep on ice |
| FBS | Cellgro | 35-011-CV | http://cellgro.com |
| 50 ml conical tubes | Falcon | 14-432-22 | fischersci.com |
| 40 micron filter | Falcon | 08-771-1 | fischersci.com |
| 5 ml syringe | BD | 14-823-35 | fischersci.com |
| surgical scissors/forceps | Roboz | RS-5910 | roboz.com |
| PBS | Cellgro | MT-21-030-CM | http://cellgro.com; keep on ice |
| trypan blue | Cellgro | MT-25-900-CI | fischersci.com |
| hemacytometer | Hausser Scientifice | 02-671-54 | fischersci.com |
| Live/Dead stain | Life Technologies | L34957 | lieftechnologies.com |
| FlowJo software | TreeStar, Inc | flowjo.com |
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